Box—Behnken效應面法優化玄參的提取工藝

孫莉君　馬婧　楊靜　胡海濤　王越

【摘要】目的：應用Box-Behnken效應面法優化玄參的提取工藝。方法：以乙醇體積分數、溶媒比、提取時間為自變量，以總評“歸一值”（包括安格洛苷C、哈巴苷、哈巴俄苷的含量及浸膏率）作為因變量，對自變量的各個水平采用二項式擬合，用Box-Behnken效應面法對提取工藝進行優化。結果：玄參的最優提取工藝為：提取時間75min，溶媒比為8倍，82%的乙醇，提取2次。二項式擬合復相關系數高（r=0.9777），回歸模型的預測值與測定值的偏差率為-2.51%。結論：Box-Behnken效應面法優選的玄參提取工藝，合理可行，操作簡便。

【關鍵詞】玄參；提取工藝；Box-Behnken效應面法

【中圖分類號】R284.2【文獻標志碼】A【文章編號】1007-8517（2015）20-0011-03

OptimizationofExtractionTechnologyforRadixScrophulariaebyBox-BehnkenResponseSurfaceMethodology

SUNLijun1MAJingi1YANGJing1HUHaitao2WANGYue1

1.DaqingPeoplesitalHeilongjiangDaqing163316China；

2.DaqingMunicipalFoodandDrugInspectionCenterHeilongjiangDaqing163316China

Abstract：Objective：TooptimizeextractiontechnologyofRadixScrophulariaebyBox-Behnkendesign.Methods：Totaketheextractiontime，solventratioandtheethanolconcentrationasindependentvariables，andtakeoveralldesirabilityasdependentvariable（includingthecontentofangorosideC，harpagide，harpagosideandextractyield），binomialformulawasusedtofiteachlevelofindependentvariables，optimizingextractionprocessbyBox-Behnkendesignandpredictionwascarriedoutthroughcomparingobservedandforecastedresults.Results：Optimalextractiontechnologyasfollows：extracted2timesfor75minuteseachtimewith8timesamountof82%ethanol.Regressioncoefficientofbinomialfittingcomplexmode1wasashighas0.9777.Biasbetweenobservedandpredictedvalueswas-2.51%.Conclusion：OptimalextractionprocessofRadixScrophulariaewasstableandreasonable.

Keywords：RadixScrophulariae；extractionproces；Box-Behnkenresponsesurfacemethod

玄參（RadixScrophulariae）為玄參科（Scrophulariaceae）玄參屬植物玄參（ScrophularianingpoensisHemsl.）的干燥根[1]。玄參味甘、苦、咸，性微寒，具有清熱涼血，瀉火解毒，滋陰的功效。臨床主要用于溫邪入營，內陷心包，溫毒發斑，熱病傷陰、舌絳煩渴等癥。現代研究發現，玄參根中含生物堿、糖類、氨基酸、甾醇、脂肪酸等成分[2]，具有保肝[3]、降血壓、保護心臟[4]、抗菌[5]、降血糖[6]等多種藥理活性。為了合理利用玄參的藥用資源，實驗以玄參中主要藥效成分安格洛苷C、哈巴苷、哈巴俄苷的含量及浸膏率為考察指標，應用Box-Behnken響應面法對玄參進行工藝優化，旨在為玄參的合理應用與開發提供實驗依據。

1儀器與材料

1.1儀器LC-20AT型高效液相色譜儀（N2000雙通道色譜工作站，日本島津）；METTLERME104電子分析天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；101A-3B型電熱恒溫鼓風干燥箱（武漢亞華電爐有限公司）、PL-S30型超聲波清洗器（東莞康士潔超聲波科技有限公司）。

1.2材料玄參藥材購自黑龍江省藥材公司，經大慶食品藥品檢驗中心鑒定為玄參科植物玄參（ScrophularianingpoensisHemsl.）的干燥根。哈巴俄苷對照品（批號：111730-201205，中國食品藥品檢定研究院）；安格洛苷C對照品（批號：061209）、哈巴苷對照品（批號：090320）均購自上海尚誼化工科技有限公司。乙腈為色譜（天津恒興化學試劑制造有限公司），水為娃哈哈純凈水，其余試劑均為分析純。

2方法與結果

2.1安格洛苷C、哈巴苷、哈巴俄苷含量的測定

2.1.1色譜條件色譜柱：Phenomenexluna（250mm×4.6mm，5.0μm）；流動相：乙腈（A）-水（B）梯度洗脫（0～5min，A：5%→30%；5～7min，A：30%→50%；7～20min，A：50%→60%；20～25min，A相60%→75%）；檢測波長：哈巴俄苷、安格洛苷C為280nm，哈巴苷為210nm；流速：1.0ml/min；進樣量：10μl，柱溫：35℃。

2.1.2混合對照品溶液的制備精密稱取安格洛苷C、哈巴苷、哈巴俄苷對照品適量，置于5ml量瓶，用甲醇溶解后稀釋到刻度，搖勻，即制成安格洛苷C0.62mg/ml，哈巴苷0.46mg/ml，哈巴俄苷0.58mg/ml的混合對照品溶液。

2.1.3供試品溶液的制備精密稱取玄參5g，置于250ml圓底燒瓶，加適量乙醇，回流法提取適當時間，過濾，殘渣同法提取，合并濾液后減壓濃縮，甲醇溶解并定容至20ml，搖勻，過微孔濾膜，即得。

2.1.4線性關系考察精密吸取“2.1.2”項下的混合對照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml置10ml量瓶，甲醇定容，搖勻。取10μl按“2.1.1”色譜條件測定。以峰面積為縱坐標，質量濃度為橫坐標，制作標準曲線，得回歸方程如下：哈巴苷Y=95384X+226941（r=0.9997），在0.023～0.46mg范圍內線性關系良好；安格洛苷CY=592655X-43685（r=0.9998），在0.031～0.62mg范圍內線性關系良好；哈巴俄苷Y=536974X+201232（r=0.9993），在0.029～0.58mg范圍內線性關系良好。

2.1.5精密度試驗取“2.1.2”項下混合對照品溶液10μl，重復進樣6次，按上述色譜條件測定，結果哈巴俄苷、哈巴苷、安格洛苷C峰面積的RSD值分別為1.3%、0.98%、1.25%，表明該儀器精密度良好。

2.1.6穩定性試驗精密吸取同一供試品溶液，分別于0、3、6、12、24h進樣測定，結果哈巴苷、哈巴俄苷、安格洛苷C峰面積的RSD分別為1.26%、1.05%、0.91%，說明該樣品在24h內穩定。

2.1.7重復性試驗稱取同一樣品，平行制備得到供試溶液6份，按上述色譜條件測定，結果哈巴苷、哈巴俄苷、安格洛苷C含量平均值（n=6）分別為2.62%、0.285%、0.183%，RSD分別為0.99%、1.2%、1.4%，表明該方法具有良好重復性。

2.1.8加樣回收率試驗分別精密稱取9份已知哈巴苷、哈巴俄苷、安格洛苷C含量的玄參藥材粗粉各5g。分別準確加入哈巴苷、哈巴俄苷、安格洛苷C對照品溶液適量，制備低、中、高三個質量濃度樣品，按上述“2.1.3”項下制備供試品溶液，按“2.1.1”色譜條件測定。哈巴苷、哈巴俄苷、安格洛苷C平均回收率分別為98.27%（RSD為1.3%）、101.5%（RSD為1.7%）、100.8%（RSD為1.6%）。說明該方法回收率良好。

2.2玄參提取工藝的優選

2.2.1試驗設計在單因素實驗基礎上選取乙醇體積分數、溶媒比、提取時間和提取次數為考察因素。由于提取次數屬于非連續變量，難以回歸分析，結合實際應用及文獻[7-9]，將提取次數定為2次。每個自變量的低、中、高水平分別以-1，0，1進行編碼，因素水平見表1。以玄參中主要有效成分哈巴苷、哈巴俄苷、安格洛苷C的含量及浸膏得率為評價指標，試驗安排及結果見表2。采用“歸一化法”[10]和Hassan方法[11]對各指標進行數學轉換，計算公式如式①：

di=（Yi–Ymin）/（Ymax–Ymin）

①

總評“歸一值”（overalldesirability，OD），計算公式如式OD=（d1×d2……dn）1/n

②

表1Box-Behnken因素設計水平

表2Box-Behnken試驗設計及結果

2.2.2模型和方差分析使用Design-Expert7.0軟件進行二項式擬合，模型如下：

Y=0.55+1.25×10-3X1+0.14X2-0.15X3+0.045X1X2-0.099X1X3+0.035X2X3-0.086X12-0.087X22-0.16X32（r=0.9777）

由表3可知，提取時間和溶媒比對結果的影響非常顯著，X32的偏回歸系數非常顯著，X12和X22的偏回歸系數顯著。模型擬合檢驗結果非常顯著能夠說明該方程較為符合實際情況。回歸方程失擬檢驗不顯著，說明模型誤差較小，模型可用。

表3回歸方程的方差分析

2.2.3工藝條件優化與預測根據二次多項式模型，作響應曲面圖，根據所擬合的響應曲面形狀，乙醇體積分數、提取時間、溶媒比對玄參中各主要成分含量及浸膏得率的影響，響應面圖見圖1～3。根據已建的模型，得最佳條件為提取時間74.66min，溶媒比7.86倍，體積分數為82.11%。考慮實際生產情況及操作的可行性，將各因素條件進行微調，最終確定玄參最佳提取工藝為溶媒比8倍，乙醇體積分數82%，提取2次，每次75min。

2.2.4驗證試驗按照以上得到的最佳工藝條件進行驗證試驗（n=3），結果得到安格洛苷C含量為0.236%（RSD為2.36%）；哈巴苷含量為3.136%（RSD為1.96%）；哈巴俄苷含量為0.362%（RSD為1.82%）；浸膏得率為22.18%（RSD為1.69%）；總評歸一值為0.622，最大預測值為0.638，偏差率為-2.51%，說明本模型可靠，具有較好的預測性。

3討論

目前，中藥及復方的提取工藝多采用正交設計和均勻設計，但二者的實驗次數偏少，存在精度低的缺點[12]。響應面法因模型擬合度高，實驗結果準確，在中藥及復方的提取工藝中越來越受到關注。實驗采用Box-Behnken效應面法對玄參的提取工藝進行了優化，得到的結果準確，模型預測性良好，為玄參的工業化提取提供了實驗依據，同時也為起臨床的合理應用奠定了基礎。

參考文獻

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（收稿日期：2015.07.17）