搜風祛痰中藥復方對ApoE基因敲除小鼠動脈粥樣硬化不穩定斑塊HO-1和PPARγ表達的影響*

遲映雪　宮麗鴻

（1.遼寧中醫藥大學，遼寧沈陽110000，2.遼寧中醫藥大學附屬醫院，遼寧沈陽110000）

·研究報告·

搜風祛痰中藥復方對ApoE基因敲除小鼠動脈粥樣硬化不穩定斑塊HO-1和PPARγ表達的影響*

遲映雪1宮麗鴻2

（1.遼寧中醫藥大學，遼寧沈陽110000，2.遼寧中醫藥大學附屬醫院，遼寧沈陽110000）

目的觀察搜風祛痰中藥復方對AopE基因敲除小鼠動脈粥樣硬化（AS）不穩定斑塊血紅素氧化酶（HO-1）和過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）的影響。方法將造模成功的ApoE基因敲除小鼠，分別給予阿托伐他汀以及低劑量、中劑量、高劑量穩斑湯干預，模型對照組采用生理鹽水灌胃。給藥13周后，取腹主動脈脈，取小鼠主動脈組織HE染色進行病理學觀察，并采用免疫組化和RT-PCR技術檢測HO-1和PPARγ的表達水平。結果各組小鼠腹主動脈組織中HO-1和PPARγ的表達水平治療組明顯高于模型對照組（P＜0.01）。結論搜風祛痰中藥復方穩斑湯可能通過影響HO-1和PPARγ的表達而干預AS斑塊形成及破裂。

搜風祛痰中藥復方ApoE基因敲除小鼠AS不穩定斑塊HO-1PPARγ

急性冠脈綜合征為冠狀動脈粥樣硬化斑塊由穩定性斑塊致易損性斑塊、不穩定斑塊破裂、血栓形成而產生的，動脈粥樣硬化不穩定斑塊的破裂是引起急性心臟事件的原因。因此穩定動脈粥樣硬化斑塊為防治急性冠脈綜合征的關鍵一環。目前常規西藥在防治冠心病過程中對肝功能、腎功能的損害無法避免，而動脈粥樣硬化斑塊的形成和破裂的中藥防治的研究是人們關注的新熱點和方向。本實驗以ApoE基因敲除小鼠為研究對象，通過高脂飼養造出動脈粥樣硬化不穩定斑塊模型，并給搜風祛痰中藥復方穩斑湯干預，研究斑塊中的血紅素氧化酶（HO-1）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）表達情況，以推測其在斑塊形成及破裂中的作用，從而為中藥有效安全的穩定斑塊提供理論依據。

1　材料與方法

1.1實驗動物6～8周齡Apo E基因敲除小鼠（系C57BL/6 J，北京大學實驗動物中心美國Jackson實驗室引進并培育成功）70只，雌雄各半，SPF級，體質量18～20 g。

1.2藥物穩斑湯，藥物組成：全蝎10 g，蜈蚣2條，地龍15 g，陳皮15 g，法半夏15 g，白術15 g，水蛭15 g。藥材由遼寧中醫藥大學附屬醫院中藥局提供，加工制成含生藥2 g/mL的中藥濃縮液備用。

1.3試劑和儀器SP試劑盒（北京博奧森生物科技有限公司）。DAB顯色試劑盒（北京博奧森生物科技有限公司）。兩步法RT-PCR試劑盒（北京全式金生物技術有限公司）。

1.4模型制備小鼠飼以含脂肪21%、膽固醇0.15%的高脂飼料（60Coγ滅菌照射處理），13周后，隨機處死4只，取腹主動脈根部，HE染色觀察基礎動脈粥樣硬化硬度，確定造模成功。

1.5分組及給藥將造模成功的ApoE基因敲除小鼠60只隨機分為模型對照組、穩斑湯低劑量組、穩斑湯中劑量組、穩斑湯高劑量組及西藥組，每組12只。正常C57BL/6 J小鼠12只設為空白對照組，給予正常飼料喂養。空白對照組小鼠不給藥，模型對照組給予0.3 mL/d的生理鹽水；根據成人每日用藥臨床推薦的常用劑量，按成人與小鼠的體質量折算系數9.0折算成小鼠用量。穩斑湯低劑量組給予穩斑湯61.75 g/（kg·d）、穩斑湯中劑量組給予穩斑湯123.5 g/（kg·d）、穩斑湯高劑量組給予穩斑湯247 g/（kg·d），西藥組給予阿托伐他汀鈣0.27 mg/（kg·d），各組均灌胃給藥13周，每日1次。

1.6標本采集與檢測取材前夜禁食，經小鼠眼眶靜脈叢采血，離心分離血清，-80℃凍存備。處死全部小鼠，無菌條件下取出心臟及主動脈，心臟10%甲醛固定，主動脈放在凍存管內液氮驟冷保存。

1.6.1主動脈組織病理學觀察每組隨機取5只小鼠，麻醉處死，無菌條件下取每只小鼠的主動脈根部取4個相同的切面，分別為（1）升主動脈最近端橫截面，切面形態呈圓形；（2）主動脈瓣附著部位，并有冠狀動脈開口；（3）主動脈瓣起始橫截面；（4）主動脈瓣完全出現并匯合在一起，生理鹽水沖洗，10%甲醛中性溶液固定。常規石蠟包埋，均勻間斷切片，厚度約5 μm。HE染色，普通光鏡下觀察主動脈根部組織及斑塊的形態結構；Masson染色，普通光鏡下觀察各斑塊中纖維成分的分布。

1.6.2免疫組織化學檢測采用SP法，常規滴加一抗、二抗，DAB顯色，蘇木精復染，用有計數格的目鏡，高倍視野下計數浸潤于內膜的單核細胞數，每個標本計數5個視野，取其平均值，即為該標本單核細胞浸潤數值。以染色系數統計HO-1免疫組化染色結果。

1.6.3實時定量RT-PCR檢測先提取總RNA，然后取4 μL總RNA經反轉錄酶及隨機引物等反應物混合配成20 μL體系，42℃15 min，95℃，2 min反轉錄成cDNA，隨后進行實時熒光定量PCR反應，分別對小鼠PPARγ、HO-1的表達進行測定。

1.7統計學處理應用SPSS15.0統計軟件。計量資料以（±s）表示。組間比較用t檢驗，多組均數比較用方差分析，不同指標間用直線相關分析。

2　結果

2.1各組小鼠形態學改變的比較各組小鼠腹主動脈HE染色形態學改變見圖1。空白對照組：動脈內膜附有一層內皮細胞，內皮細胞層呈現皺褶狀排列，但排列均勻，表面光滑，未見泡沫細胞及炎性細胞。模型對照組：血管腔內可見明顯的粥樣硬化斑塊出現，斑塊表面附有纖維帽，纖維帽主要由平滑肌細胞、彈力纖維和膠原組織構成，斑塊中央可見大量的脂質聚集，斑塊內可見大量泡沫細胞，偶見炎性細胞浸潤；未出現斑塊的動脈內膜區域嚴重破損。穩斑湯低劑量組：血管腔內可見粥樣硬化斑塊，斑塊面積明顯小于模型對照組，斑塊內脂質含量較模型組少，斑塊內可見少量泡沫細胞及炎性細胞；未出現斑塊的動脈內膜區域形態較為完整，偶見內膜殘缺。穩斑湯中劑量組、穩斑湯高劑量、西藥組：動脈內膜大部分較為光滑，偶見內膜不全，內膜不全區域可見明顯的脂質條紋塊形成，偶見泡沫細胞聚集，有少量纖維成分交聯。

圖1　各組小鼠腹主動脈（HE染色，100倍）

2.2各組小鼠HO-1表達水平比較見圖2。HO-1蛋白陽性表達主要在血管內皮細胞（EC）、泡沫細胞及血管平滑肌細胞（VSMC）內，以含棕褐色顆粒的細胞為HO-1蛋白表達的陽性細胞。空白對照組陽性細胞主要分布于內膜，HO-1蛋白表達在EC內；模型組HO-1蛋白表達明顯降低，偶見弱陽性表達；中藥中劑量、高劑量及西藥組表達水平顯著升高，廣泛表達于EC、VSMC及斑塊的泡沫細胞內。

圖2　各組小鼠腹主動脈組織（DAB顯色，100倍）

各組小鼠腹主動脈組織中HO-1表達水平見表1、表2和圖3。Apo E基因敲除小鼠的免疫組化結果表明，穩斑湯和阿托伐他汀均能提高斑塊內HO-1的陽性表達（P＜0.01）。

表1　各組小鼠腹主動脈組織中HO-1蛋白表達水平（±s）

表1　各組小鼠腹主動脈組織中HO-1蛋白表達水平（±s）

與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組別n空白對照組5模型對照組5穩斑湯低劑量組5 HO-1蛋白表達0.265±0.009 0.199±0.011*0.283±0.009*△穩斑湯中劑量組50.310±0.010*△穩斑湯高劑量組50.317±0.012*△西藥組50.315±0.008*△

2.3各組小鼠PPAR-γ表達水平比較見表3，圖4。Apo E-小鼠的RT-PCR結果表明，搜風祛痰中藥復方穩斑湯和阿托伐他汀均能提高各組小鼠腹主動脈組織中PPAR-γ mRNA表達水平（P＜0.01）。

表2　各組小鼠腹主動脈組織中HO-1 mRNA表達水平（±s）

表2　各組小鼠腹主動脈組織中HO-1 mRNA表達水平（±s）

組別n空白對照組5模型對照組5穩斑湯低劑量組5 HO-1 mRNA表達水平0.270±0.024 0.227±0.022*0.290±0.037△△穩斑湯中劑量組50.318±0.029*△△穩斑湯高劑量組50.367±0.041**△△西藥組50.385±0.033**△△

圖3　各組小鼠腹主動脈組織中HO-1 mRNA表達電泳圖

表3　各組小鼠腹主動脈組織中PPARγ mRNA表達水平（±s）

表3　各組小鼠腹主動脈組織中PPARγ mRNA表達水平（±s）

組別n空白對照組5模型對照組5穩斑湯低劑量組5 PPARγ mRNA表達水平0.266±0.013 0.228±0.013*0.290±0.028△穩斑湯中劑量組50.347±0.026*△穩斑湯高劑量組50.395±0.013*△西藥組50.405±0.021*△

圖4　各組小鼠腹主動脈組織中PPARγ mRNA表達電泳圖

3　討論

冠狀動脈粥樣硬化斑塊的形成是一個由多種因素參與的漫長復雜的過程，其發病機制尚不明晰，炎性反應在不穩定斑塊形成及破裂中起著重要作用。HO是血紅素代謝的起始酶和限速酶，有HO-1、HO-2、HO-3 3種存在形式，近年研究表明［1］，HO-1對心血管系統具有重要的保護作用。心臟過表達HO-1的小鼠具有改善缺血/再灌注損傷心功能和抗細胞凋亡作用［2］。研究認為在動脈硬化斑塊中PPARγ可以抑制單核巨噬細胞表達炎性物質減輕炎性反應并具有抑制血管平滑肌細胞游走和增生的作用［3］。Jagdip等［4］研究發現PPAR激動劑羅格列酮能明顯降低無糖尿病的冠心病患者E-選擇素血管性假血友病因子、C反應蛋白、纖維蛋白原和IRI，減輕炎癥。反應研究發現ACS組PPARγ mRNA表達比SAP組明顯降低PPARγ mRNA表達與冠脈病變支數病變類型呈負相關進一步說明PPARγ mRNA表達與冠脈病變呈負相關對動脈粥樣硬化具有負調控作用。

中醫學認為，痰濁由津液凝聚而成，津血同源，都因水谷精微化生。長期恣食肥甘厚味易生痰濁而成為痰濁形成的外因。痰濁一旦形成上犯于胸，致胸陽痹阻，又可壅滯脈道，使氣血不能暢行，致心脈痹阻而成胸痹。《景岳全書》“痰飲”認為“果使脾強胃健，如少壯者流，則水谷隨食隨化，皆成氣血，焉得留而為痰”。張仲景論胸痹之脈為陽微陰弦，浮取而微，系胸中陽氣虛衰，沉取而弦乃陰寒之邪內盛，痰涎水飲壅阻，邪正博結，形成胸中阻塞而痛。本實驗選用復方穩斑湯，方中全蝎、蜈蚣息風止痙、解毒散結，蜈蚣兼能通絡止痛；地龍清熱息風、平喘通絡止痙，共為君藥。陳皮、半夏、白術合用，既能燥濕化痰又可寬胸理氣、消痞散結，為臣藥。水蛭為蟲類活血藥、破血逐瘀，為佐藥。合方共奏搜風祛瘀通絡之功效。風為百病之長，其性善行而數變；痰為百病之祟。風藥善于宣暢氣機，疏通血絡，消除瘀滯，尤其蟲類風藥更以行走攻竄見長，善通經絡壅滯，開啟孔竅閉塞，故能通利心絡，開通心竅，善止痹痛。近年來，隨著“痰邪致病”理論的深入認識，痰瘀互結被認為是冠心病的重要病機［5-6］。沈紹功［7］認為，冠心病的治療應從傳統的“活血化瘀”、“補氣活血”轉到“補氣祛痰”、“痰瘀同治”上來，提出痰濁虛證宜補氣祛痰，痰濁實證宜痰瘀同治。

本實驗研究結果表明搜風祛痰中藥復方穩斑湯能有效干預動脈粥樣硬化斑塊的形成及破裂．其可能通過調節HO-1和PPARγ的表達發揮作用。

［1］William Durante．Heine oxygenase-1 in growth control and its clinical application to vascular disease［J］．Journal of Cellular Physiology，2003，195（6）：373-382．

［2］Yet SF，Tian R，Layne MD，et al.Cardiac-specific expression of hemeoxygenase-1 protects against ischemia and reperfusion injury intransgenic mice［J］.Circ Res，2001，2（89）：168-173.

［3］RE Law，S Goetze，Xiaoping Xi，et al.Expression and function of PPARγ in rat and human vascular smooth muscle cells［J］. Circulation，2000，101：1311.

［4］Jagdip SS，Dahlia C，Juan CK.The effects of rosiglitazone a peroxisome proliferator activated receptor-gamma agonist on markers of endothelial cell activation C-reactive protein and fibrinogen levels in non-diabetic coronary artery disease patients［J］.J Am Coll Cardio，2003，11（42）：1757.

［5］韓學杰．冠心病心絞痛痰瘀互結證的本質探討［J］．中國中醫基礎醫學雜志，2002，8（10）：53．

［6］徐學勤，陳慶云．試論痰瘀與冠心病的相關問題［J］．中國中醫基礎醫學雜志，2002，8（10）：55．

［7］沈紹功，診治冠心病的新思路［J］.中國中醫急癥，1999，8（2）：51.

Study of Compound Soufengqutanwenban Decoction on Expression of HO-1 and PPARγ in ApoE Gene Knock-out Rats with Atherosclerosis Unstable Plaque

CHI Yingxue1，GONG Lihong2.1 Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Liaoning，Shenyang 110000，China；2 Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Liaoning，Shenyang 110000，China

Objective：To observe the effect of Compound Soufengqutanwenban Decoction on unstable plaque in ApoE gene knockout rats with atherosclerosis.Methods：The successful model of the ApoE-gene knockout rats were given low dose，medium-dose and high-dose Soufengqutanwenban Decoction and western medicine for a month.At the same time，the model group was fed by normal saline for one month.After treatment for 13 weeks，aortic tissue was observed under optical microscope pathology after HE staining.And then levels of HO-1 and PPARγ were detected by immunohistochemistry and RT-PCR technique.Results：HO-1 and PPARγ expression levels in aortic tissue of rats in treatment groups were significantly higher than those in control group（P＜0.01）.Conclusion：Compound Soufengqutanwenban Decoction may stabilize plaques by regulating the expression of inflammatory factors and interfering the formation and rupture of AS plaque，which provides a new idea to prevent AS.

Compound Soufengqutanwenban Decoction；ApoE gene knockout rats；AS；Unstable plaque；HO-1；PPARγ

R285.5

A

1004-745X（2015）01-0004-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.01.002

2014-10-19）

中國博士后面上項目（20110491540）；遼寧省百千萬人才項目（2011921022）