紫花苜蓿子葉的高頻離體再生體系的建立與優(yōu)化

徐博 任偉 王英哲 等

摘要：以東北地區(qū)農(nóng)藝性狀優(yōu)良的不同品種紫花苜蓿的子葉為材料，研究了不同培養(yǎng)基和不同配比對紫花苜蓿愈傷組織誘導(dǎo)和分化的影響。結(jié)果表明，最佳胚型愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+2 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L KT；最佳分化培養(yǎng)基為UM+1.2 mg/L KT；不同基因型在愈傷誘導(dǎo)率上差異顯著，其中公農(nóng)5號表現(xiàn)最佳。紫花苜蓿的高頻再生體系的建立，為下一步紫花苜蓿的遺傳轉(zhuǎn)化工作打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：紫花苜蓿（Medicago sativa L.）；愈傷誘導(dǎo)；分化；再生

中圖分類號：S963.22+3.3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）20-5159-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.20.059

Establishment and Optimization of High-frequency Regeneration System

in Vitro of Medicago sativa Cotyledon

XU Bo1，REN Wei2，WANG Ying-zhe3， SUN Qi-zhong3， GUO Wei4，LOU Yu-jie1

（1. College of Animal Science and Technology， Jilin Agricultural University， Changchun 130118， China； 2. Jilin Academy of Agricultural Sciences， Gongzhuling 136100， Jilin， China； 3. Grassland Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Huhhot 010010， China； 4. Jilin Province Animal Husbandry， Changchun 130062， China）

Abstract：The cotyledon and hypocotyI of five varieties of Medicago sativa with fine agronomic characteristics in the northeast China were used to study the effects of different medium and proportions on induction and differentiation of Medicago sativa callus. The results showed that， the optimum embryonic callus induction medium was the MS medium containing a combination of 2， 4-D 2 mg/L and KT 0.5 mg/L； The optimum differentiation medium was the UM medium containing a combination of KT 1.2 mg/L； Significant difference was detected in callus induction ratio of different genotypes of Medicago sativa， in which the best ration was Gongnong NO.5. The establishment of high-frequency regeneration system in vitro of Medicago sativa laid a solid foundation for the next genetic transformation of Medicago sativa.

Key words： Medicago sativa； callus induction； differentiation； regeneration

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）是世界上最重要的牧草之一，享有“牧草之王”的美譽(yù)，是中國牧草產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程中非常重要的牧草之一，其適應(yīng)性好，可以顯著改善土壤理化性質(zhì)。雖然紫花苜蓿在中國分布廣泛，但也存在對不同地區(qū)的適應(yīng)性不強(qiáng)以及被反芻動物取食時發(fā)生鼓脹病等問題?；蚬こ碳夹g(shù)作為一種能夠?qū)ΜF(xiàn)有品種材料進(jìn)行遺傳改良、獲得創(chuàng)新種質(zhì)的手段，被大量運(yùn)用于植物的品種改良中。而在利用已知基因建立一個高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系時，穩(wěn)定且可操作的植物高頻再生體系的建立就顯得尤為重要。Sanders等[1]在1972年首次獲得了紫花苜蓿的再生植株。植物的再生高度依賴于其基因型，尤其是部分栽培品種的再生都比較困難[2]。而紫花苜蓿的再生也存在這一問題，不同的品種、品系，其再生體系差異較大[3]。研究人員以不同材料、不同外植體為基礎(chǔ)材料，成功獲得了再生植株[4，5]，但普遍存在再生周期長、再生效率低下及可重復(fù)性差等缺點(diǎn)[6]。

由于東北地區(qū)冬季十分寒冷，春季存在“倒春寒”問題，導(dǎo)致在該地區(qū)種植的紫花苜蓿優(yōu)良品種相對稀少。中國鹽堿地面積較大，在東北地區(qū)也有相當(dāng)面積的鹽堿地。苜蓿作為一種中度耐鹽植物，將苜蓿種植在輕度鹽堿地上，既能改良土壤又能提供飼料，既有經(jīng)濟(jì)價值，又能兼顧社會效益和生態(tài)效益[5]。耐堿轉(zhuǎn)GsGSTs基因的紫花苜蓿植株，其產(chǎn)量和形態(tài)性狀與對照差異不顯著，但其耐鹽性提高明顯[6]。在枯草芽孢桿菌的果聚糖合成酶基因轉(zhuǎn)入紫花苜蓿的研究中，獲得的轉(zhuǎn)基因苜蓿的耐鹽性得到了一定增強(qiáng)[7]。在將HAL1基因轉(zhuǎn)入龍牧803紫花苜蓿的研究中，所得到的轉(zhuǎn)基因苜蓿在NaCl濃度為0.6%～1.0%的范圍內(nèi)依然能夠正常生長，而未轉(zhuǎn)基因植株則在NaCl濃度達(dá)到0.6%時就全部褐化并死亡[8]。紫花苜蓿公農(nóng)1號、公農(nóng)2號、公農(nóng)5號、龍牧801和龍牧803產(chǎn)量高、抗寒性強(qiáng)，是中國東北地區(qū)大面積推廣種植的優(yōu)良苜蓿品種。本研究以適應(yīng)東北地區(qū)的優(yōu)良苜蓿品種為試驗(yàn)材料，建立了穩(wěn)定、周期短、可重復(fù)的紫花苜蓿高頻離體培養(yǎng)體系，為未來建立紫花苜蓿高效遺傳轉(zhuǎn)化體系、耐鹽性強(qiáng)的優(yōu)秀種質(zhì)材料的獲得和抗逆性育種研究提供一定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

以紫花苜蓿的子葉為試驗(yàn)材料，對公農(nóng)1號、公農(nóng)2號、公農(nóng)5號、龍牧801、龍牧803進(jìn)行了愈傷誘導(dǎo)和分化比較試驗(yàn)，種子由吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院草地研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 無菌苗的培養(yǎng) 選取各品種紫花苜蓿的飽滿種子，分別在75%乙醇滅菌2 min，轉(zhuǎn)入0.1%氯化汞溶液滅菌5 min，以無菌水沖洗3～5次，接種至MS培養(yǎng)基上。

1.2.2 愈傷組織的誘導(dǎo) 無菌苗培養(yǎng)7 d，取子葉，在愈傷組織誘導(dǎo)階段，采用MS培養(yǎng)基，加不同濃度2，4-D和KT進(jìn)行培養(yǎng)。試驗(yàn)設(shè)9個組合處理：A1，MS+2，4-D 1 mg/L+KT 0.25 mg/L；A2，MS+2，4-D 1 mg/L+KT 0.5 mg/L；A3，MS+2，4-D 1 mg/L+KT 1.0 mg/L；A4，MS+2，4-D 2 mg/L+KT 0.25 mg/L；A5，MS+2，4-D 2 mg/L+KT 0.5 mg/L；A6，MS+2，4-D 2 mg/L+KT 1.0 mg/L；A7，MS+2，4-D 5 mg/L+KT 0.25 mg/L；A8，MS+2，4-D 5 mg/L+KT 0. 5 mg/L；A9，MS+2，4-D 5 mg/L+KT 1.0 mg/L。3次重復(fù)，每次重復(fù)選100片子葉，每種培養(yǎng)基放20片子葉，愈傷組織誘導(dǎo)階段培養(yǎng)時間為30 d。所有培養(yǎng)基均加入30 g/L蔗糖、2 g/L瓊脂，pH調(diào)節(jié)至5.8后滅菌，下同。

1.2.3 愈傷組織的分化 在愈傷組織誘導(dǎo)20 d后，將愈傷組織轉(zhuǎn)入含30 g/L蔗糖和不同濃度KT（0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/L）的UM培養(yǎng)基中，每20 d更換一次培養(yǎng)基，在分化培養(yǎng)40 d 后統(tǒng)計(jì)分化率，每種培養(yǎng)基選擇20個愈傷組織，3次重復(fù)。整個分化過程培養(yǎng)條件為光照16 h/d，溫度25±1 ℃。

1.2.4 根的誘導(dǎo)及移栽 將在分化培養(yǎng)基上萌發(fā)的小苗移至蔗糖含量為15 g/L的1/2 MS 培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3周后，待根系生長至10 cm左右時，將培養(yǎng)用錐形瓶去掉封口膜，置于室內(nèi)陰涼處煉苗1 d，洗凈根系上的培養(yǎng)基，移栽至含營養(yǎng)土∶蛭石=1∶1的混合基質(zhì)中，溫室培養(yǎng)10 d后統(tǒng)計(jì)成活率。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 愈傷組織的誘導(dǎo)效果

在愈傷組織誘導(dǎo)初期，子葉初步形成質(zhì)地柔軟、顏色透明的愈傷組織，而后其中一部分愈傷組織逐漸形成綠色顆粒狀物質(zhì)。這種含綠色顆粒狀的愈傷組織往往能夠在分化培養(yǎng)中形成小植株[9]。不同培養(yǎng)基激素配比、形成柔軟透明愈傷組織外植體的數(shù)量和最終形成綠色顆粒狀胚型愈傷組織外植體的數(shù)量都差異顯著（P<0.05）。從圖1可知，黑色柱是柔軟型愈傷組織的誘導(dǎo)率，白色柱是胚型愈傷組織的誘導(dǎo)率，A5處理兩種類型愈傷組織誘導(dǎo)率均最高。在植物愈傷組織誘導(dǎo)中，2，4-D的通常用量為2 mg/L，尤其在紫花苜蓿的愈傷組織誘導(dǎo)用得較多[10]，而低濃度的KT在愈傷組織的誘導(dǎo)中往往也能起到十分重要的作用。

本研究還對適宜東北地區(qū)種植的不同紫花苜蓿品種的愈傷組織誘導(dǎo)率進(jìn)行了比較。結(jié)果（表2）表明，公農(nóng)5號紫花苜蓿的生長狀態(tài)和愈傷組織的誘導(dǎo)率高于其他幾個品種。

2.2 愈傷組織的分化結(jié)果

在將外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)30 d后，將胚型愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基上，愈傷組織上的綠色物質(zhì)逐漸變硬并開始分化出胚狀體，部分胚狀體在分化的過程中會同時分生出短小的根系，部分愈傷組織可以分化出多個胚狀體并最終形成小植株。在分化階段，經(jīng)過40 d后，含1.2 mg/L KT的UM培養(yǎng)基愈傷組織的分化率最高，而更高濃度的KT并沒有提高胚狀體的數(shù)量（表3）。

2.3 根系的培養(yǎng)和植株的移栽結(jié)果

1/2 MS培養(yǎng)基是比較合適的生根培養(yǎng)基，而低蔗糖濃度也可以促進(jìn)紫花苜蓿的根系生長。在分化階段，大部分分化的胚狀體都能夠在分化培養(yǎng)基上形成短小的根系，因此在移入生根培養(yǎng)基后，生長狀況基本良好。采用了較為合適的移栽方法，移栽后小苗的成活率均可達(dá)到90%以上，其中最需注意的是移栽時根系上培養(yǎng)基的清洗。從愈傷組織誘導(dǎo)、分化、生根到移栽的整個過程如圖2所示。

3 結(jié)論與討論

3.1 2，4-D和KT對愈傷組織形成和胚性愈傷的作用

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，2 mg/L 2，4-D作用下愈傷組織的誘導(dǎo)率較高，而加入較低濃度的KT可以促進(jìn)愈傷組織的形成和胚性愈傷的發(fā)生，但其濃度超過一定量時，反而會抑制胚性愈傷組織的產(chǎn)生。在分化時，單獨(dú)加入一定濃度的KT即可以獲得較高的分化率，而且在分化培養(yǎng)后期，大部分幼芽會產(chǎn)生根系，這一方面會提高后期生根培養(yǎng)和成苗的難度，同時也驗(yàn)證了這樣的激素配比是較為平衡的培養(yǎng)基組成，對于體細(xì)胞胚的產(chǎn)生也是有利的。

3.2 不同品種對植株再生的影響

許多研究表明，不同品種的紫花苜蓿其再生能力有較大差異，而這種差異在不同再生體系中表現(xiàn)也不盡相同。秘魯苜蓿、金皇后、甘農(nóng)1號、龍牧801等品種都可用于紫花苜蓿高頻再生體系的建立，雖然選用的再生體系都不同，均取得了較高的分化率。一般基因型雜合程度越高，其體細(xì)胞胚的形成能力就越強(qiáng)，再生能力也高[10，11]，而這種再生能力是可以高度遺傳的[12，13]。本試驗(yàn)選擇的公農(nóng)5號苜蓿其愈傷率高，且分化率也較高，適合進(jìn)一步用于紫花苜蓿的遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立。

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