超快速冷凍法在犬精子冷凍保存中的應用

于善一 鐘友剛 施振聲

目前，犬精子的傳統慢速冷凍法雖已廣泛應用，但仍存在諸多不足。超快速冷凍法可以實現精子玻璃化，有望進一步提高冷凍質量。研究分別以蔗糖濃度為0M、0.05M、0.1M、0.125M、0.15M、0.2M、0.25M等滲溶液（約300mOsm/L）作為冷凍液，利用微粒法對犬精子進行超快速冷凍，并對復蘇后精子的總活力、存活率、頂體完整性、畸形率進行評價。結果表明，0.125M蔗糖組的總活力為40.1±2.0%，存活率60.4±2.8%，頂體完整性65.6±10.5%，存在顯著優勢。超快速冷凍法能夠消除傳統方法中冷凍保護劑的毒性和污染，操作快捷、經濟，但冷凍效果仍存在相當的提升空間，值得進一步研究與探討。

一、概述

精子冷凍技術是犬繁殖項目中的重要技術。通過液氮對預處理后的精子進行超低溫冷凍可以保存優良品種、提高繁殖效率、降低傳染病風險。經典的犬精子冷凍技術需要添加甘油、卵黃或低密度脂蛋白等，作為精子的冷凍保護劑，同時應用價格昂貴的程序化冷凍儀進行“慢速”冷凍，全過程耗時3～4小時。另外，甘油作為一種滲透性冷凍保護劑的添加會直接引起細胞毒性，進而影響受孕率。而現在已有研究者利用超快速冷凍法進行人精子冷凍保存，并獲得成功。該方法應用玻璃化冷凍的原理，最大程度減少細胞內外冰晶的形成，同時避免了甘油等滲透性冷凍保護劑的使用，高效、快速、成本低廉。本研究嘗試將超快速冷凍法應用于犬精子冷凍保存，以求為今后犬繁殖相關科研、臨床項目提供參考。

二、材料

（一）試驗動物

選 用2～6 歲 公 犬4 頭( 雜 種犬），飼喂全價日糧食。試驗前均經過3～5 次訓練，可以順利進行人工按摩法采精且對操作耐受良好。同一犬采精間隔5 天或以上。精子活力大于80%的精液可作為試驗樣本。

（二）試驗試劑

自配人輸卵管液（human tubal fluid，HTF） 、蔗糖、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、吉姆薩染液、中性紅、甲醛、鹽酸。

（三）主要儀器

Olympus CX41 相 差 顯 微 鏡、Makler Counting Chamber 精子計數板、20 目篩等。

三、試驗方法

（一）精液采集與預處理

人工按摩法采精后，對精子活力、密度、畸形率、存活率（低滲膨脹試驗）、頂體完整性（吉姆薩染色）進行評價。同時以700g離心5min 后，棄上清并用HTF 重懸沉淀，調整精子重懸液密度為100x106/ml。室溫下保存。

（二）冷凍液準備

將0.3M 蔗糖水溶液與HTF 以6 種不同比例混合作為冷凍液，并以20:1的比例加入預先處理的精液（終密度5x106/ml）后，使冷凍液中蔗糖的終濃度分別達到0M、0.05M、0.1M、0.125M、0.15M、0.2M、0.25M。同時添加1%BSA。

（三）冷凍設備準備

將20 目篩放入泡沫箱中后注入液氮，使液面高3～5cm。靜置5min 后備用。

（四）冷凍過程

方 法 依 照Isachenko（2008）。將配置好的精子懸液于液氮上方8cm 處懸置30s 后，用30μl 移液器以45°角滴入液氮中，使液滴形成小的固態顆粒。待顆粒沉入篩網中后，加入下一滴。用1.8ml 冷凍管收集顆粒，與液氮中保存24h 以上。

（五）解凍

將5個顆粒依次投入4ml 預熱37℃的HTF（含1%BSA）中，輕輕搖晃8s 后，于37℃水浴3min。

（六）評估

對解凍后精子的總活力、存活率、頂體完整性、畸形率進行評價。使用吉姆薩染色法進行頂體完整性評價。具體評價方法參考WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen，5th ed。

（七）統計分析

使用SPSS 21 進行統計分析。使用單因素ANOVA 中的最小差異性顯著法（Least Significant Difference，LSD）進行顯著性分析，并以a（P<0.05）和b（P<0.01）表示。試驗結果均以“平均值±均值標準誤（Mean±SEM）”表示。試驗重復3次。

四、結果

新鮮精液總活力83.8±3.2%，頂體完整性96.4±1.2%，存活率90.8±0.6%，畸形率16.4±5.6%。快速冷凍后評估結果如表1。冷凍后各組精子總活力、存活率、頂體完整性與新鮮精液相比均存在極顯著差異（P<0.01），畸形率之間無差異（P>0.05）。

表1 不同蔗糖濃度對精子超快速冷凍效果的影響（%）

（一）總活力

以0M 組 為 對 照 組，0.1M、0.125M、0.15M、0.2M、0.25M 組 與之相比差異顯著。另外，根據數據統計，0.125M 組與其他各組的精子總活力均存在顯著差異（P<0.05）。

（二）存活率

以0M 組 為 對 照 組，0.125M、0.15M、0.2M、0.25M 組 與 之 存 在顯著差異。另外，除0.15M 組、0.2M 組外，其他各組的精子存活率與0.125M 組相比存在顯著差異（P<0.05）。

（三）頂體完整性

以0M 組為對照組，僅0.125M組的精子頂體完整性與之存在顯著差異（P<0.05）。

（四）畸形率

各組之間的精子畸形率無顯著差異（P>0.05）。

五、分析討論

研究設置6 組滲透壓相似（約300mOsm/L）的蔗糖-HTF 溶液并以此作為冷凍液，對微量精子（5x106/ml）進行超快速冷凍（方法參考自Sánchez）。試驗選用總活力、頂體完整性、存活率、活力等基本精子評估指標，對冷凍效果進行評價和比較。將其中主要結果繪制為柱狀圖，見圖1，其中Control 為0M 組，即無蔗糖組。如圖所示，應用超快速冷凍方法進行犬精子冷凍時，各組復蘇后精子均有一定的活力。但0.125M 組在精子總活力、存活率、頂體完整性方面均具有優勢。2011年，Sánchez 等在犬精子超快速冷凍研究中設立了0.05M、0.125M、0.2M 三組濃度蔗糖并評價冷凍效果差異，結果表明0.125M 組具有明顯優勢，精子活力可達42.5 ± 2.3%。但是，該三組蔗糖設置對應的滲透壓約為200mOsm/L、275mOsm/L、350mOsm/L。由于犬精子對滲透壓的敏感性較高，因此在冷凍之前精子就可能由于高滲或低滲而受損進而喪失活力。因此，本試驗設立等滲蔗糖梯度試驗，即配制0.05M 至0.25M 等6 組蔗糖濃度的同時，保持各組滲透壓的相似性。

圖1 不同蔗糖濃度的冷凍效果差異對比

有研究者分別利用NaCl、葡萄糖、半乳糖、果糖、甘油、乙二醇、DMSO 等物質提高溶液滲透壓，針對犬精子的滲透壓耐受性進行了評價。結果表明，添加NaCl 并引起的滲透壓增高至500mOsm/L 時，犬精子活力或質膜完整性均降至約30%；高于700mOsm/L 時則幾乎完全喪失活力。而不同的單糖（葡萄糖、果糖、半乳糖）使滲透壓上升至500mOsm/L 時，精子質膜完整性仍保持約70%，但活力下降至約40%。這意味著高濃度的冷凍保護劑雖然理論上有助于精子冷凍效果，但本身具有的高滲透壓可能使犬精子提前喪失活力。因此在冷凍液設計上需要加以平衡。

所謂“超快速冷凍法”是實現哺乳動物精子玻璃化冷凍的具體方法。“超快速”一詞與傳統冷凍的“慢速”相區別，其過程中無需平衡，亦無程序降溫，而是直接將樣本放入液氮或-160℃環境中。慢速冷凍的降溫時間為2～3 小時，而超快速冷凍最低僅為5 秒。研究者通過不同的冷凍載體，以實現快速降溫。如嘗試使用5mm 直徑的銅環、鋁箔表面顆粒冷凍、開放式拉長細管、開放式細管、微滴法、Cell Sleeper 等對人類精子進行超快速冷凍。各種方法均以實現精子玻璃化為目的，但最終效果有所差異。Mazur 于1972年提出“雙因子假說”認為，細胞在冷凍過程中要平衡滲透壓變化與冰晶形成兩大因素。但玻璃化觀點的提出和實踐在一定程度上跨越了雙因子假說的討論范圍，以新的視角討論冷凍保護與冷凍損傷。

“玻璃化”本是自然存在的一種物理過程，在嚴寒氣候下生存多種昆蟲或兩棲類動物體內多存在這種現象。燈蛾毛蟲在一年中有10個月冰凍在-50℃環境中卻仍然可以生存。某些品種的青蛙體內65%水分凍結后，依然可以存活數日甚至數周。有些動物如北極蛙類可以通過分泌胰島素刺激葡萄糖釋放并進入細胞，同樣可對機體形成保護。而甘油、葡萄糖蔗糖這類物質則被認為是一種“冷凍保護劑”，可以使動物的體液在低溫時固化卻不形成晶體——這便是玻璃化轉變的過程。從熱力學角度講，隨著溫度降低，液體開始向固體轉變，若該過程中液體的分子排布和熱力學狀態并不發生改變，則溶液會形成一種無冰晶的高粘滯“玻璃態”，這一過程被稱為玻璃化。研究表明，玻璃態的形成與冷凍保護劑的濃度、降溫速度、終溫度相關，不論是滲透性冷凍保護劑還是非滲透性冷凍保護劑，其濃度越高，則玻璃化所需要的降溫速度越慢。但是，精子無法耐受高濃度滲透性冷凍保護劑，因此可嘗試通過高速降溫和復溫過程，以實現細胞內外溶液的玻璃化。這種思路已在實踐中得到證實。

六、結語

研究以HTF、0.125M 蔗糖、1%BSA為配方作為犬精子超快速冷凍的冷凍液，獲得了較好的保存效果。超快速冷凍方法以實現精子樣本玻璃化為目的，能夠消除傳統方法中冷凍保護劑的毒性和污染，操作快捷、經濟，但冷凍效果仍存在一定的提升空間，值得進一步研究與探討。