A20突變與彌漫大B細胞淋巴瘤臨床病理特征及預后的關系

庹櫻籃 陳琴 楊文秀

·臨床研究與應用·

A20突變與彌漫大B細胞淋巴瘤臨床病理特征及預后的關系

庹櫻籃 陳琴 楊文秀

目的：檢查彌漫大B細胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）中腫瘤壞死因子誘導蛋白3基因（tumor necrosis factor，alpha-induced protein 3 gene，A20基因）突變情況，探討其對DLBCL進展、預后及腫瘤耐藥的影響。方法：收集104例DLBCL病例及其臨床資料并隨訪部分病例，應用免疫組織化學染色檢測腫瘤細胞中P-gP和Ki-67蛋白表達；聚合酶鏈反應擴增和DNA測序檢測A20基因外顯子3、6、7突變情況；分析A20基因與DLBCL臨床病理特征及預后的關系。結果：104例DLBCL中，A20基因3號外顯子存在錯義突變，總突變率17.3%。其中第73位突變率在ABC-DLBCL與GCB-DLBCL病例之間差異具有統(tǒng)計學意義（18.5%vs.2.5%，P=0.010）；在臨床分期晚和高IPI指數(shù)的DLBCL病例中，A20突變率明顯高于相應的早臨床分期和低IPI指數(shù)病例（P＜0.05）。在A20基因突變與未突變病例之間P-gP表達的差異有統(tǒng)計學意義（16/18 vs.52/86，P=0.021），Ki-67低表達與高表達病例之間差異有統(tǒng)計學意義（低表達/高表達：1/17 vs.26/60，P=0.030）；與未突變病例比較，A20基因突變的DLBCL病例復發(fā)率有增高的趨勢（P=0.06），生存狀況較差（P=0.016）。結論：DLBCL病例中A20基因的突變對DLBCL的臨床病理特征及生存狀況有一定影響，A20基因突變可能是DLBCL預后不良的相關因子。

淋巴瘤 A20 突變 預后

彌漫性大B細胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）是常見的非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin's lymphoma，NHL）類型，屬于侵襲性的大細胞淋巴瘤，2008年的WHO淋巴造血組織腫瘤分類將其分為十幾種亞型［1］。核因子κB（nuclear factor-kappaB，NF-κB）異常活化對DLBCL發(fā)生和演進的影響越來越受到重視。腫瘤壞死因子誘導蛋白3基因（tumor necrosis factor alpha-induced protein 3 gene，A20基因）位于染色體6q23.3（為侵襲性B細胞淋巴瘤缺失高發(fā)的區(qū)域），其編碼的A20蛋白作為腫瘤抑制因子，可以負調(diào)節(jié)NF-κB通路的活化［2-3］。有學者在黏膜相關結外邊緣區(qū)B細胞淋巴瘤（extra-nodal marginal zone B cell lymphoma of mucosa-associated lymphoid tissue，MALT）中發(fā)現(xiàn)A20基因的缺失突變或缺失異常（18%～22%），在DLBCL中檢出A20突變和甲基化等異常［2，4-5］。目前的研究認為NF-κB信號傳導通路的持續(xù)活化是彌漫大B淋巴瘤的重要特征。由此推測DLBCL中A20的異常可能通過減少對NF-κB活化的抑制而影響DLBCL的發(fā)展和預后。本研究收集了一組DLBCL病例，檢測A20基因突變情況、腫瘤細胞的增殖及多藥耐藥基因編碼產(chǎn)物P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gP）的表達情況，收集臨床病理資料，探討A20突變與DLBCL臨床過程、預后及腫瘤耐藥的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

收集貴陽醫(yī)學院附屬醫(yī)院病理科2005年1月至2013年6月期間診斷的部分原發(fā)于結內(nèi)或結外的彌漫大B細胞淋巴瘤病例。按照2008年WHO淋巴造血組織腫瘤分類［1］，進行病例篩選，其中符合診斷標準、具有完整病理和臨床資料的104例DLBCL被納入研究。DLBCL的分型參考Hans標準分為2個亞型：GCB樣（CD10+或CD10-/bcl-6+/MUM1-）和non-GCB樣即ABC樣（CD10-/ bcl-6+/MUM1+或CD10-/bcl-6-/MUM1+）。其中GCBDLBCL 39例，ABC-DLBCL 65例。

1.2 方法

1.2.1 蘇木素伊紅染色按照常用病理操作規(guī)范進行［6-7］。

1.2.2 免疫組織化學染色采用S-P三步法，并根據(jù)抗體要求進行枸櫞酸鹽高壓熱修復。一抗P-gP（邁新公司）為單克隆-即用型，單克隆抗體Ki-67（1:100）和免疫組化檢測試劑盒均購自中杉公司。以0.01M PBS（pH=7.2～7.4）的PBS代替一抗作空白對照。

陽性結果判定：P-gP陽性信號定位于細胞漿和細胞膜，Ki-67陽性信號定位于細胞核。每張切片計數(shù)10個400倍視野，計數(shù)1 000個細胞中的陽性細胞數(shù)，取10個400倍視野的均值。Ki-67蛋白以腫瘤細胞表達百分率劃分為2個等級，即＜40%（低表達）及≥40%（高表達）。P-gP蛋白以細胞質(zhì)和細胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒的腫瘤細胞數(shù)＞20%為陽性。

1.2.3 A20基因突變檢測石蠟包埋組織DNA提取及PCR擴增：3～8 μm厚石蠟切片置于EP管中，二甲苯脫蠟、無水乙醇清洗、蛋白酶K消化，用酚-氯仿法提取DNA，分光光度計測提取DNA的吸光度值（260/ 280的比值）。A20基因外顯子3、6、7的PCR擴增引物序列：外顯子3上游5'-TCTTCTCCTCCTTTCTGT CC-3，下游5'-GTACCCTATGCCCACCAT-3'（產(chǎn)物271 bp）；外顯子6上游5'-CTTGTTTAGTAGAATACT GTTTTACTTATG-3，下游5'-GGTGGCTGAGGTTAA AGACA-3'（產(chǎn)物291 bp）；外顯子7上游5'-CTGGTA GATGATTACTTTGAACTTG-3，下游5'-GGGCGTTTC ACATTTTACAT-3'（產(chǎn)物150 bp）；PCR循環(huán)參數(shù)：94℃預變性3 min；94℃變性45 s，退火（溫度依次為56℃、58℃、58℃）45 s，72℃延伸40 s，循環(huán)40次，總延伸72℃10 min。PCR產(chǎn)物以2%瓊脂糖凝膠電泳進行觀察，PCR產(chǎn)物送上海生工基因公司進行雙向測序，對有突變病例再進行了反向測序證實。

1.2.4 隨訪隨訪資料通過患者門診復查、電話隨訪結合信函調(diào)查獲得。以首次明確病理診斷為隨訪開始時間，2013年12月31日為隨訪結束時間。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行處理分析。組間比較，采用χ2檢驗，計量資料采用獨立樣本t檢驗，生存分析采用Kaplan-Meier方法繪制生存曲線，生存曲線的比較采用對數(shù)秩檢驗（Log-rank test），以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 臨床病理特征

104例DLBCL病例被納入研究。其中男性59例，女性45例，男女之比1.31:1，發(fā)病年齡24～87歲，中位年齡56歲；發(fā)生于結內(nèi)64例，結外40例；臨床分期：Ⅰ期39例，Ⅱ期20例，Ⅲ期15例，Ⅳ期30例；IPI指數(shù)0～2為65例，3～5為39例；有B癥狀38例，無B癥狀66例；LDH值109～245 U/L 70例，＞245 U/L有34例。

2.2 A20基因突變檢測結果

104例DLBCL樣本的A20基因外顯子3、6、7的PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，均可見目的條帶（圖1）。

104例DLBCL中18例存在A20基因突變，總突變率為17.3%（18/104）。均為3號外顯子的錯義突變（表1，圖2）。

2.3 A20基因3號外顯子突變與DLBCL類型及臨床病理特征的關系

檢測到A20基因3個位點突變，在73堿基位點，ABC-DLBCL突變率為18.5%（12/65），GCB-DLBCL突變率為2.5%（1/39），差異具有統(tǒng)計學意義，即第3號外顯子73位是A20基因的主要突變位點，為非隨機突變。3號外顯子208和131位點的突變可能是隨機突變，兩種淋巴瘤亞型之間差異無統(tǒng)計學意義（表2）。

A20基因突變在臨床分期較早（Ⅰ期，Ⅱ期）與較晚（Ⅲ期，Ⅳ期）病例之間有統(tǒng)計學差異，IPI指數(shù)0～2組與3～5組病例之間A20突變亦有差異（表3，P均＜0.05）。2.4A20突變與P-gP和Ki-67表達的關系

DLBCL腫瘤細胞中不同程度地表達P-gP和Ki-67（圖3A，B）。P-gP陽性表達率65.4%（68/104）；Ki-67陽性表達率27例＜40%，77例≥40%。DLBCL中A20基因突變在Ki-67低表達組（＜40%）與高表達組（≥40%）之間以及P-gP陽性與陰性表達組之間差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，表4）。

圖1 A20基因3、6、7外顯子PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結果Figure 1PCR products of exons 3，6，and 7 of A20 gene on agarose electropherogram

表1 A20基因錯義突變類型Table 1Types of missense mutation of A20 gene

圖2 A20基因第3外顯子DNA序列Figure 2DNA sequence of exon 3 of A20 gene

表2 A20基因3號外顯子突變與DLBCL類型的關系Table 2Correlation between the types of mutation in exon 3 of A20 and DLBCL

表3 A20基因突變與DLBCL臨床病理特征的關系Table 3Correlation between the genetic mutation of A20 and clinicopathologic features of DLBCL

2.5 隨訪

104例彌漫大B細胞淋巴瘤中有隨訪結果者62例，獲訪率為59.6%。隨訪時間為1～123個月，中位隨訪時間為40個月。62例獲訪病例中，生存33例，死亡29例（ABC-DLBCL 20例、GCB-DLBCL 9例），復發(fā)34例，死亡的29例中23例死于腫瘤，4例死于化療反應，2例死于其他疾病。62例進行腫物切除；腫物切除后治愈2例，47例接受化療治療，CHOP化療方案37例，療程1～6個；余病例治療方案不祥。

DLBCL的復發(fā)與DLBCL類型和Ki-67有關，ABC-DLBCL及腫瘤細胞高增殖活性的DLBCL復發(fā)率高（P＜0.05）。DLBCL死亡病例與A20基因突變、Ki-67高表達、高IPI評分及B癥狀等關系密切（P＜0.05）。同時，根據(jù)62例DLBCL病例A20基因突變情況繪制生存曲線（圖4），A20基因突變與未突變病例之間生存狀況有明顯差異（P=0.016）。此外，在62例隨訪病例中，A20突變13例，其中ABC-DLBCL 12例（死亡9例），GCB-DLBCL 1例（死亡1例）。根據(jù)40例ABC-DLBCL病例A20基因突變情況繪制生存曲線（圖5）。經(jīng)生存分析結果顯示，A20突變是ABCDLBCL病例不良預后的獨立因素（P＜0.05，表5）。

圖3 DLBCL腫瘤組織中P-gp、Ki-67表達情況Figure 3Expression of P-gp and Ki-67 protein in DLBCL tissues

表4 DLBCL中A20基因突變與兩種蛋白表達的關系Table 4Correlation of abnormality of A20 with expression of Ki-67 protein and P-gP

圖4 A20基因突變與未突變病例的生存曲線比較（P=0.016）Figure 4Comparison of survival functions between the cases with and without A20 mutation（P=0.016）

圖5 ABC-DLBCL病例A20基因突變與未突變病例的生存曲線（P= 0.024）Figure 5Comparison of survival functions between the cases with and without A20 mutation in DLBCL（P=0.024）

表5 DLBCL患者預后與臨床病理特征的關系Table 5Correlation between the relapse and death of DLBCL and its clinicopathologic characteristics

3 討論

DLBCL是一組異質(zhì)性的侵襲性淋巴瘤，近年來發(fā)病率逐漸上升，目前歐美國家發(fā)病約占NHL的31%［8］，我國病例已占到NHL的45.8%［9］。不同DLBCL亞型臨床過程和預后不盡一致，僅根據(jù)臨床分期、腫瘤細胞增殖指數(shù)、國際預后指數(shù)（international prognosis index，IPI）等惡性腫瘤通用的預后預測因素不能滿足對異質(zhì)性的DLBCL臨床過程、預后、化療效果等預測的需要。腫瘤的遺傳學和分子生物學改變影響腫瘤的預后已被廣泛報道。因此，在診斷時識別出影響DLBCL臨床過程和預后、化療效果的關鍵因素，對預后估計和治療方案選擇非常必要，同時也是尋求DLBCL治療新靶點的重要基礎。

NF-κB持續(xù)性活化是腫瘤發(fā)生發(fā)展的一個重要因素。由于A20與NF-κB通路活化相關，故被看作是一個腫瘤抑制因子［2］。A20蛋白是一種新型的鋅指蛋白，具有去泛素化酶功能［10］。在TNF作用下或者TNF-R1過表達時，A20蛋白與IKKγ相互作用，阻斷IKKγ將上游信號傳遞給IKKα和IKKβ亞基，從而阻止NF-κB的活化［11］，通過影響凋亡蛋白酶的合成而抑制細胞凋亡。關于A20基因對淋巴瘤的影響，有研究［12］發(fā)現(xiàn)將野生型A20基因導入A20缺失的淋巴瘤細胞株SUDHL2、RC-K8、L-1236和KM-H2中可以顯著減少NF-κB表達，并且可以促進細胞凋亡和抑制細胞的增殖；將野生型A20基因導入A20基因正常或無NF-κB構成性活化的細胞株，則不能發(fā)揮其相應的作用。這一結果提示了A20作為A20缺失腫瘤的靶向基因治療的可行性。國外有研究報道［13］，在多種淋巴瘤中存在A20基因的缺失或者突變。

目前關于A20基因在淋巴瘤中的變化國外已有一些報道，而A20基因在DLBCL中變化的研究缺乏系統(tǒng)報道。有研究統(tǒng)計A20基因發(fā)生缺失或突變高頻率位點在外顯子3、6和7［14］。本研究通過PCR擴增和直接測序，檢查了A20基因外顯子3、6、7的DNA突變情況。結果發(fā)現(xiàn)DLBCL中A20基因的DNA錯義突變率為17.3%，較Dong等［15］的研究報道中錯義突變率（21%）略低。同時發(fā)現(xiàn)DLBCL中外顯子3的第73位的堿基突變率達12.5%，而第208位和131位堿基突變率分別為2.8%和1.9%，第73位堿基突變應是非隨機突變，后兩種突變不除外隨機突變的可能。統(tǒng)計分析還發(fā)現(xiàn)ABC-DLBCL與GCB-DLBCL病例之間A20總突變率差異無統(tǒng)計學意義（21.5%vs.10.2%），但就主要突變位點（第73位堿基）分析，上述兩組病例之間差異有統(tǒng)計學意義。推測該突變損害A20基因的功能，最終可能影響DLBCL尤其是ABC-DLBCL的發(fā)生發(fā)展，這仍需要更進一步的研究證實。

IPI包含年齡、血清乳酸脫氫酶、行為狀況評分、Ann Arbor分期、淋巴結結外受侵數(shù)目［16］。本研究臨床病理特征分析發(fā)現(xiàn)，在晚臨床分期和高IPI指數(shù)的DLBCL病例中A20基因突變較多見，此外，多藥耐藥基因（multi-drug resistance gene，mdr gene）是NF-κB的靶基因，A20突變的DLBCL中mdr編碼的產(chǎn)物P-gP蛋白表達明顯增多。A20基因突變病例與野生型病例相比，腫瘤細胞Ki-67表達明顯增高，后者是腫瘤細胞增殖活性的標志［17］。可以推測A20基因異常可能通過NF-κB對相關靶基因的調(diào)節(jié)而影響腫瘤細胞的增殖活性。生存分析也發(fā)現(xiàn)，A20基因突變的DLBCL病例復發(fā)率較未突變的DLBCL病例有升高的趨勢；單因素生存分析發(fā)現(xiàn)A20基因突變病例的生存狀況明顯差于未突變病例。結果表明，A20基因突變對DLBCL的臨床過程、腫瘤耐藥和預后有一定程度的影響。這可能與腫瘤中A20基因突變而失活，對NF-κB的負調(diào)節(jié)作用減弱有關，使NF-κB持續(xù)活化，從而上調(diào)了mdr等靶基因。這一信號通路中，NF-κB作用的下游靶基因有待于下一步深入研究。A20突變對A20蛋白表達的影響也值得研究。

總而言之，一部分DLBCL中存在A20基因突變，而且這一遺傳學改變與DLBCL的發(fā)生發(fā)展和預后有關，對DLBCL的臨床病理特征有一定的影響，可能是DLBCL不良預后的相關因素。

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（2015-08-15收稿）

（2015-09-30修回）

（編輯：鄭莉）

Relationship of A20 mutation with clinicopathologic features and prognosis of diffuse large B cell lymphoma

Yinglan TUO，Qin CHEN，Wenxiu YANG

Department of Pathology，Guizhou Medical University，Guiyang 550004，China

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China（No.81160299）.

Wenxiu YANG；E-mail:ypq1964@163.com

Objective:To detect A20 mutation and to investigate its relationship with clinicopathologic features，prognosis，and resistance to therapy of diffuse large B cell lymphoma（DLBCL）.Methods:A total of 104 cases with DLBCL and their clinical data were collected；follow-up was performed on a few of DLBCL patients.The expression of P-gP and Ki-67 protein was detected with immunohistochemical staining.The A20 gene mutation in exons 3，6，and 7 were examined by polymerase chain reaction and DNA sequencing. Finally，the correlation of genetic abnormality of A20 with clinicopathologic features was analyzed.Results:Missense mutation in exon 3 of A20 gene was identified in 18 of 104 patients（17.3%）.The A20 gene mutation at site 73 of exon 3 was greater in the cases with activated B cell-like-DLBCL than with germinal center B-cell-like-DLBCL（18.5%vs.2.5%，P=0.010）.In contrast to the advanced clinical stage and high International Prognostic Index（IPI）cases，the rate of A20 mutation was superior to the opposite（P＜0.05）.The expression for P-gP was higher in the cases with mutation than that of those with wild-type A20 gene（16/18 vs.52/86，P=0.021）.The difference in A20 mutation between the groups of low and high positive expression for Ki-67（1/17 vs.26/60，P=0.030）was significant. DLBCL with A20 mutation had an increasing recurrence tendency（P=0.06）and a worse survival（P=0.016）compared with those with wild-type A20 gene.Conclusion:The A20 mutation has a certain influence on the clinicopathologic characteristics and survival conditions of BLBCL patients.Probably，A20 mutation is a factor associated with a poor prognosis of DLBCL.

lymphoma，A20，mutation，prognosis

10.3969/j.issn.1000-8179.2015.20.882

貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院病理科（貴陽市550004）

楊文秀ypq1964@163.com

庹櫻籃專業(yè)方向為淋巴瘤基礎研究與臨床。

E-mail：1024028096@qq.com