乳腺癌轉移淋巴結T細胞克隆性分析

張建波 呂曉東 楚廣民 宋魏 馮穩 劉明閣 于慶凱

(1.鄭州大學附屬腫瘤醫院 病理科 河南 鄭州 450003;2.鄭州大學附屬腫瘤醫院 中心實驗室 河南 鄭州 450003)

T 細胞在機體抗腫瘤免疫應答中起重要作用，它以識別腫瘤相關抗原的T 細胞克隆性增生為特點［1］。研究證明多種實體瘤患者體內存在針對腫瘤抗原特異反應的T 細胞克隆，分析這些克隆性增生的T 細胞，對于了解機體抗腫瘤的免疫狀態以及開展特異性免疫治療有重要意義［2］。本研究旨在利用免疫掃描譜型技術檢測乳腺癌轉移淋巴結中T 細胞的克隆性增生情況，分析TCR BV 亞家族選擇性取用特點，為進一步的研究打下基礎。

1 材料與方法

1.1 標本 選取河南省腫瘤醫院確診為乳腺浸潤性導管癌(組織學Ⅱ級)住院患者10 例，均為女性，年齡28 ～73 歲，經術中快速冰凍檢查明確腋窩前哨淋巴結有癌微轉移標本。同時取2 例反應性增生淋巴結標本作為對照。

1.2 主要試劑 Trizol reageant、SuperScript ⅢReverse Transcriptase、LD PCR PrimerⅡA 購自美國Invitrogen公司，Advantage 2 Polymerase Mix 購自美國BD Biosciences Clontech 公司，TaqDNA 聚合酶購自美國Promega公司，膠純化試劑盒購自美國Omega biotek 公司。

1.3 RNA 提取及cDNA 合成 將癌轉移淋巴結周圍的淋巴組織及對照組淋巴結標本在200 目篩網上進行研磨后用PBS 進行沖洗，收集細胞懸液并計數，提取總RNA 合成20 μl cDNA。

1.4 PCR 擴增24 個TCR BV 亞家族 根據文獻設計并合成24 個TCR BV 亞家族上游引物及共用的FAM 標記下游引物和對照引物［3］，引物由上海英俊生物技術有限公司合成。總反應體系50 μl，其中cDNA模板1 μl，dNTP 5 μl，10 ×buffer 5 μl，25 mmol/L 氯化鎂3 μl，上游引物1.8 μl，共用FAM 標記的下游引物1.8 μl，Taq DNA 聚合酶1.25 U。反應條件為:預變性94 ℃3 min;94 ℃1 min，55 ℃1 min，72 ℃1 min，35個循環;72 ℃延伸10 min。取PCR 產物7 μl 在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳。

1.5 利用GeneScan 技術分析TCR BV 家族的優勢取用 取5 μl 熒光引物擴增的TCR BV 各亞家族PCR產物與3μl DNA 變性膠上樣緩沖液混合，從中取出2 μl加入0.5 μl 標準品。94 ℃變性4 min 后上樣至6%聚丙烯酰胺凝膠，373 DNA 序列分析儀中電泳分析結果，用GeneScan 672 軟件基因掃描分析。

2 結果

2.1 T 細胞TCR BV 亞家族RT－PCR 結果 10 例乳腺癌轉移淋巴結與反應性增生淋巴結標本中全部24個TCR BV 亞家族均有擴增，擴增片段大小在150 ～350 bp(圖1、圖2)。由于同一亞家族其上游BV 引物、下游BC 引物在TCRβ 鏈中的位置是固定的，所以PCR 擴增產物大小取決于多樣區基因(BD)以及BV－BD、BD－BJ 基因之間(CDR3)隨機插入核苷酸的多少。

圖1 對照組1 的24 個TCR BV 亞家族PCR 擴增結果

圖2 病例1 的24 個TCR BV 亞家族PCR 擴增結果

圖3 對照組1 的24 個TCR BV 亞家族GeneScan 掃描圖

2.2 T 細胞中TCR CDR3 GeneScan 分析及TCR BV 亞家族的表達 2 例反應性增淋巴結24 個BV 亞家族均有表達，基因掃描呈多個峰的譜型，即Gaussian分布，提示為多克隆(圖3)。10 例乳腺癌患者檢測結果顯示大部分BV 亞家族呈現與反應性淋巴結相似的多峰圖像，少部分家族呈單一主峰，提示PCR產物為CDR3 長度完全相同的T 細胞，也就是單克隆細胞;還有少部分為單一主峰伴個別極低的小峰，提示產物主要來自同一克隆也就是寡克隆性;也有個別為多克隆逐漸向寡克隆形式發展，稱為寡克隆增生趨勢，各病例24 個BV 亞家族的表達和克隆性結果見表1。圖4為病例1 的24 個TCR BV 亞家族CDR3 的基因掃描譜型圖，其中BV2 呈單一主峰，BV7、BV23 呈單一主峰和少數小峰圖像，即寡克隆，其余BV 亞家族基本為多峰圖像。

圖4 病例1 的24 個TCR BV 亞家族GeneScan 掃描圖

表1 10 例乳腺癌24 個TCR BV 亞家族表達和T 細胞克隆性特點

3 討論

T 細胞通過TCR 識別抗原，由于TCR 的β 鏈由V－D－J－C 基因片斷重排后編碼，可構成具有不同特異性的TCR 分子，由此決定T 細胞識別抗原的多樣性和特異性。TCR 重排過程中，V－D－J 的基因片段進行重排和隨機插入核甘酸(N 區)形成一高度可變區，稱為互補決定區3(CDR3)［4］。通過對CDR3 長度和序列的分析，可作為判別T 細胞克隆性的指標。PCR－GeneScan(基因掃描)－序列分析方法［5］通過檢測CDR3 的長度是否相同以確定T 細胞的克隆性，然后對出現單克隆或寡克隆的PCR 產物進行序列分析，從而了解其CDR3 的核甘酸序列，是檢測T 細胞克隆性較為理想的方法。

利用該方法，本研究檢測了10 位乳腺癌患者轉移淋巴結內的T 細胞克隆，結果顯示大部分病例均存在T 細胞的克隆性增生，增生形式有單克隆、寡克隆、寡克隆趨勢及譜型偏移，說明乳腺癌患者轉移淋巴結中存在針對乳腺癌相關抗原的T 細胞克隆性增生。T 細胞在乳腺癌相關抗原的持續刺激下，某一個或者某些與乳腺癌相關抗原有高親和力的T 細胞克隆得到優勢表達并克隆性增生，通過分析這些T 細胞克隆，可以了解機體相應的細胞免疫反應［2］。本研究中1 例患者未發現T 細胞的克隆性表達，只是表現為譜型的偏移，類似的譜型偏移在其他病例也有不同程度的出現，可能與T 細胞對腫瘤相關抗原的反應性克隆性增生處于一個動態反應的過程有關［6］。各患者優勢表達的T 細胞克隆亞家族不同，可能與乳腺癌腫瘤抗原的多樣性以及個體差異有關。如果對克隆性T 細胞PCR 擴增產物測序，分析其CDR3 氨基酸序列，能進一步了解選擇相同BV 亞家族的T 細胞克隆是否來自相同的T 細胞群。

總之，本研究通過分析乳腺癌轉移淋巴結T 細胞的克隆性增生情況，為了解機體抗腫瘤免疫應答反應提供了依據，也為尋找腫瘤抗原表位、個體化免疫治療打下了基礎。

［1］He X Y，Yang W M，Tang W T，et al.TRAV gene expression in PBMCs and TILs in patients with breast cancer analyzed by a DNA melting curve (FQ－PCR)technique for TCR α chain CDR3 spectratyping［J］.Neoplasma，2012，59(6):693－699.

［2］Sherwood A M，Emerson R O，Scherer D，et al.Tumor－infiltrating lymphocytes in colorectal tumors display a diversity of T cell receptor sequences that differ from the T cells in adjacent mucosal tissue［J］.Cancer Immunol Immunother，2013，62(9):1453－1461.

［3］姚新生，馬驪，溫茜，等.監測TCR CDR3 漂移的免疫掃描譜型分析技術的建立與鑒定［J］.中華微生物學和免疫學雜志，2006，26(6):571－573.

［4］Sainz－Perez A，Lim A，Lemercier B，et al.The T－cell receptor repertoire of tumor－infiltrating regulatory T lymphocytes is skewed toward public sequences［J］.Cancer Res，2012，72(14):3557－3569.

［5］Blohm J H，Blohm N，Hummel M，et al.Detection of clonal T－cell－receptor (TCR)Vbeta rearrangements in explanted dilated cardiomyopathy hearts by semi－nested PCR，GeneScan，and direct sequencing［J］.Med Sci Monit Basic Res，2013，(19):111－117.

［6］Luo W，Liao W J，Huang Y T，et al.Cancer of the gastrointestinal tract results in a restricted T－cell repertoire dependent upon tumor differentiation［J］.Cell Immunol，2011，270(1):47－52.