粉塵螨第24組過敏原cDNA克隆表達及其免疫學(xué)特性的研究

邱聰齡，鐘小軍，黃 毅，劉曉宇，蔡澤浪，劉志剛，吉坤美

2.深圳市過敏反應(yīng)與免疫學(xué)重點實驗室，深圳 518060

3.深圳大學(xué)第一附屬醫(yī)院，深圳 518060

塵螨（dust mite）是導(dǎo)致過敏性疾病的最重要的室內(nèi)過敏原，可誘發(fā)I型變態(tài)反應(yīng)，與過敏性哮喘、過敏性鼻炎及過敏性濕疹等疾病有密切的關(guān)系[1]。我國目前有500萬以上的兒童患有過敏性哮喘、5 000萬以上過敏性鼻炎患者和3 000萬以上過敏性皮炎患者，且發(fā)病率和死亡率仍呈上升趨勢[1]。主要致敏的塵螨物種有屋塵螨（Dermatophagoides pteronyssinus，Der p）和粉塵螨（Dermatophagoides farina，Der f），兩者過敏原成分高度同源。我國華南地區(qū)粉塵螨為室內(nèi)優(yōu)勢致敏螨種[1]。

本課題組采用第2代高通量測序技術(shù)解析了粉塵螨基因組和轉(zhuǎn)錄組，并結(jié)合蛋白質(zhì)組技術(shù)首次發(fā)現(xiàn)了粉塵螨新過敏原組分—細胞色素C還原酶結(jié)合蛋白（Ubiquinol－cytochrome c reductase binding protein，UQCRB）的同源物[2]。這一研究成果被世界衛(wèi)生組織與國際免疫聯(lián)合會下屬的過敏原國際命名委員會正式命名為Der f24。

迄今為止，已經(jīng)從塵螨中分離鑒定并正式命名了24組過敏原組分。其中，塵螨第一組和第二組過敏原（如Der p1、Der p2）是目前公認的最主要的過敏原成分[3]；對第一組和第二組塵螨過敏原致敏機制研究也相對清楚，其他成分致敏機制尚不明確；Der p1可通過激活蛋白酶受體、抑制樹突狀細胞分泌IL－12等 途 徑 誘 導(dǎo) Th2 型 免 疫 反 應(yīng)[3－4]；Der p2作為模擬配體與TLR 4結(jié)合而引起Th2型免疫反應(yīng)[5]。本課題組發(fā)現(xiàn)了第24組塵螨過敏原Der f 24，目前尚無這一生化功能類型的蛋白質(zhì)作為過敏原的研究報道。本研究主要是克隆表達粉塵螨第24組過敏原cDNA，并對其免疫學(xué)特性進行初步的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑與材料 粉塵螨cDNA文庫、大腸桿菌菌株E.coliBL21（DE3）plysS、表達載體pET－His由深圳大學(xué)過敏反應(yīng)與免疫學(xué)研究所保存。粉塵螨Der f24表位肽由蘇州強耀公司合成。質(zhì)粒提取試劑、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑、DNA Marker、LA Taq DNA聚合酶、BamH I及HindIII、T4DNA ligase購自大連寶生物公司，蛋白分子量Marker購自Thermo公司，Ni2＋－Chelating Sepharose購自GE公司。Biotin偶聯(lián)鼠抗人IgE單抗購自Southern Biotechnology公司。其余試劑均為國產(chǎn)或進口分析純試劑。

1.1.2 血清標本 粉塵螨過敏患者陽性血清32例，男18例，女14例，年齡21～76歲；健康對照血清標本22例，男12例，女10例，年齡22～69歲。血清經(jīng)UniCAP Phadia 100過敏原自動檢測儀檢測，陽性血清對粉塵螨特異性IgE反應(yīng)達3級或3級以上，陰性血清對粉塵螨特異性IgE反應(yīng)為0級。血清來自廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，相關(guān)臨床實驗獲得該醫(yī)院倫理委員會的批準。

1.2 方法

1.2.1 PCR擴增Der f24cDNA及其克隆與鑒定

以粉塵螨cDNA文庫為模板，根據(jù)GenBank提供的Der f24基因序列數(shù)據(jù)（Accession No.KC669700）設(shè)計特異性引物，采用套式PCR技術(shù)，上游外引物序列為5′－CTTGTGTATATCACGCTCAG－3′上游內(nèi)引物序列為 5′－GGATCCATGGTTCATCTTACAAAAACTC－3′，下游外引物序列為5′－CTTGTGTATATCACGCTCAG－3′，下 游 內(nèi) 引物 序 列 為 5′－AAGCTTTCAATCTTTCGACAAGAAAT－3′。其 中 一 對 內(nèi) 引 物 分 別 加 入BamHI及HindIII的酶切位點。PCR反應(yīng)參數(shù)為：94。C預(yù)變性5min，94。C30s，55。C30s，72。C30s，最后72。C延伸10min。將擴增產(chǎn)物回收克隆到pMD18－T載體后進行DNA序列分析。

1.2.2 pET－His－Derf24重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建與原核表達 將Derf24cDNA質(zhì)粒雙酶切BamH I／HindIII后電泳回收目的基因，克隆至原核表達載體pET－His，構(gòu)建表達質(zhì)粒pET－His－Derf24，經(jīng)測序鑒定正確后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E.coliBL21（DE3）plysS感受態(tài)中，挑選抗氨芐青霉素（Amp）陽性菌落，在200mL LB液體培養(yǎng)基 （0.1mg／mL Amp，0.2%D－Glucose）中，37。C180r／min待細菌生長處于對數(shù)生長期（A600nm約0.6）時，加入終濃度為1mmol／L的IPTG，37。C180rpm誘導(dǎo)蛋白表達。3h后4。C10 000r／min 5min離心收集菌體。以10ml每克濕菌體的比例加入適量緩沖液（pH8.0），充分混勻；加入適量溶菌酶，冰浴攪拌溶解30min。冰浴超聲波破碎細菌：400W，超聲3s，停5s，共20個循環(huán)，重復(fù)3次。4。C13 000r／min離心20min，收集上清及沉淀小樣SDS－PAGE電泳檢測表達情況。

1.2.3 包涵體的洗滌、變性、純化及復(fù)性 將分離的包涵體，以1∶20（w／v）比例加入預(yù)冷的包涵體洗滌溶 液 （1.5mol／L Urea，50mmol／L Tris，100 mmol／L NaCl，5mmol／L EDTA，0.2% （v／v）TritonX－100，pH8.0）充分混勻；4。C，13 000r／min，離心20min，棄上清；沉淀以1：20（w／v）比例加入變性 溶 液 （6mol／L Guanidine Hydrochloride，100 mmol／L Tris，pH8.0），室溫下攪拌溶解3h；4。C，13 000r／min，離心30min；將上清上樣于已平衡Ni2＋－Chelating Sepharose層析柱（平衡緩沖液含6 mol／L Urea），待上樣完畢后用緩沖液（含6mol／L Urea）清洗，直至UV檢測（280nm）曲線水平；再用洗 脫 液 （6mol／L Urea，100mmol／L Tris，150 mmol／L NaCl，250mmol／L Imidazole，pH8.0）洗脫目的蛋白，收集目的蛋白。用梯度透析法進行復(fù)性，由于該蛋白不含半胱氨酸，無需添加還原劑。

1.2.4 Western blotting檢測rDerf 24與塵螨過敏患者特異性IgE反應(yīng)性 將上述純化的重組Der f24進行SDS－PAGE電泳，經(jīng)膠濕法轉(zhuǎn)至NC膜后進行Western blot分析。其中，一抗為粉塵螨過敏患者的血清，同時設(shè)健康對照組；二抗為生物素偶聯(lián)的鼠抗人IgE單抗，DAB顯色。其余按照Western blotting常規(guī)方法進行。

1.2.5 Der f 24 3D結(jié)構(gòu)模擬及潛在表位肽的合成利用在線軟件Swiss－Model軟件，參考模板為PDB 1PP9.F，模擬Der f24蛋白的3D結(jié)構(gòu)，并通過DNAStar軟件分析其潛在的B細胞表位，選擇其中3個肽段人工合成，分別為：表位1位于75－88位氨基酸；表位2位于44－57位氨基酸；表位3位于104－117位氨基酸。合成肽N端為Cys，SH基團用于偶聯(lián)到BSA上，合成肽經(jīng)質(zhì)譜和HPLC分析，由蘇州強耀公司完成。

1.2.6 IgE－ELISA試驗及其統(tǒng)計分析 用碳酸鹽緩沖液（pH9.0）將重組Derf24和合成肽4。C包被過夜；用含5%BSA的PBS溶液37。C封閉2h；按照1∶10的比例稀釋粉塵螨過敏患者血清及陰性對照血清37。C孵育1h；依次加入生物素標記的鼠抗人IgE、鏈霉親和素標記的辣根過氧化物酶37。C孵育，用TMB進行顯色，室溫避光靜置10min后，加入2M硫酸溶液終止反應(yīng)；在450nm波長處測定吸光度。所有統(tǒng)計學(xué)分析，均以特異的IgE的平均數(shù)比較進行。統(tǒng)計學(xué)分析采用Wilcoxon rank－sum t分布檢驗進行；P＜0.05被認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 粉塵螨Der f cDNA克隆及序列分析 以粉塵螨cDNA文庫為模板，我們先采用1對外引物進行PCR，擴增結(jié)果見圖1Lane1所示無明顯條帶，擴增不成功。隨后我們采用內(nèi)外引物各1套進行套式PCR產(chǎn)物，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，得到1條350bp左右的條帶，大小與理論預(yù)計相符（圖1，2）。這說明套式PCR具有更好的特異性。克隆后測序結(jié)果與已經(jīng)登錄 GenBank（accession No.KC669700）的Derf24基因序列數(shù)據(jù)一致。

圖1 PCR擴增Der f24cDNA電泳圖譜Fig.1 Electrophoresis analysis of PCR product of Der f24cDNA

粉塵螨Der f24cDNA序列從啟起始密碼AUG到終止密碼UGA，共357bp，已登錄Gen－Bank，登錄號為KP064571。具體序列如下：

2.2 pET－His－Der f24重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 PCR擴增的一對內(nèi)引物分別添加了BamHI和HindIII位點。通過BamHI和HindIII雙酶切Der f24cDNA基因克隆到pET－His載體上，挑取陽性克隆進行雙酶切鑒定（圖2），并重組質(zhì)粒進行DNA序列測序確認構(gòu)建了pET－His－Der f24。

圖2 pET－Der f24重組質(zhì)粒BamHI／HindIIII雙酶切Fig.2 Electrophoresis of products of pET－His－Derf24double cut by BamHI／HindIII

2.3 Der f24蛋白表達和純化 測序正確的表達質(zhì)粒 pET－His－Derf24 轉(zhuǎn) 化E.coliBL21（DE23）plysS，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達目的蛋白，進行SDSPAGE電泳分析，結(jié)果顯示陽性克隆菌株在Mr 14 000左右處有外源蛋白表達條帶出現(xiàn)，與預(yù)期大小相符；表達產(chǎn)物主要為包涵體，在超聲破碎離心后沉淀里面（如圖3）。重組蛋白經(jīng)變性后溶經(jīng)Ni2＋Chelating Sepharose FF柱層析純化再復(fù)性，獲得純的重組Der f24蛋白，濃度為0.48mg／mL，平均每升搖瓶可獲1.8mg純品（如圖3）。

圖3 pET－His－Der f24重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達Fig.3 SDS－PAGE analysis of recombinant Der f24

2.4 IgE－Weatern Blotting檢測重組Der f24 用粉塵螨過敏患者的血清作為一抗進行IgE－Weatern Blotting實驗，設(shè)健康對照陰性組。結(jié)果顯示，重組Der f24與10例粉塵螨過敏患者血清特異性IgE（UniCap檢測粉塵螨特異性均在3級以上）呈強陽性反應(yīng)，不與10例健康對照陰性組血清反應(yīng)（Uni－Cap檢測粉塵螨特異性IgE均為0級）（圖4）。

圖4 IgE－Western blotting檢測重組Der f24Fig.4 IgE－Western blotting for binding assay of rDer f24

2.5 Der f24 3D結(jié)構(gòu)模擬與表位預(yù)測 Der f24與參考模板（template：1PP9.F）氨基酸序列的同源性達56%，利用SWISS－MODEL在線軟件進行同源建模，模擬其3D分子結(jié)構(gòu)，結(jié)果見圖5。該分子模型以α螺旋為主，Coil－coli為輔，無β折疊。利用DNASTAR V7.1軟件，預(yù)測粉塵螨UQCRB樣蛋白中的B細胞抗原表位，選取三個肽段，分別為表位肽1：75－88位氨基酸肽段（綠色）；表位肽2：44－57位氨基酸肽段（紅色）；表位肽3：104－117位氨基酸肽段（藍色）見圖5。人工合成時N段添加Cys，SH基團便于與BSA偶聯(lián)（表1）。

2.6 IgE－ELISA測定表位肽與粉塵螨過敏患者血清結(jié)合反應(yīng) 取22份粉塵螨過敏患者血清和22份健康對照陰性血清作為檢測對象，進行3個表位肽IgE－ELISA實驗。統(tǒng)計學(xué)方法分析結(jié)果顯示，3個表位肽（Peptide 1：75－88aa，Z＝5.6734；Peptide 2：44－57aa，Z＝5.6720；Peptide 3：104－117aa ，Z＝5.6791；3組P＜0.0001）均與22份粉塵螨過敏患者血清特異性IgE結(jié)合，均不與22例健康對照陰性血清反應(yīng)。通過與課題組前期報道的重組Der f24 IgE－ELISA結(jié)果相比較[2]，這3個表位肽與粉塵螨過敏性患者血清特異性IgE結(jié)合反應(yīng)較弱（圖6）。

表1 粉塵螨過敏原Der f24人工合成表位肽Table 1 Synthesis of Der f24epitope peptides

圖5 粉塵螨Der f24 3D模擬結(jié)構(gòu)及其B細胞表位的預(yù)測Fig.5 Der f24 3DStructure Modeling and prediction of B－cell epitopes

圖6 IgE－ELISA檢測表位肽與粉塵螨過敏患者特異性IgE反應(yīng)性Fig.6 IgE－ELISA for binding assay of rDer f24and its epitope peptides

3 討 論

塵螨包括粉塵螨（Dermatophagoidesfarimae）、屋塵螨（Dermatophagoidespteronyssinus）埋內(nèi)歐螨（Euroglyphusmaynei）和熱帶無爪螨（Blomiatropicalis）等，它們是室內(nèi)最主要的吸入性過敏原，其螨體、排泄物和分泌物、死亡后分解物等均含有多種致敏成分，能導(dǎo)致人體產(chǎn)生過敏反應(yīng)并能引起過敏性哮喘、過敏性鼻炎、過敏性皮炎等I型變態(tài)反應(yīng)性疾病[6]。通過IgE－WB、IgE－ELISA、組胺釋放、皮膚點刺等實驗，從不同種屬的塵螨中先后發(fā)現(xiàn)了30多種不同的致敏組份，可與塵螨過敏患者血清特異的IgE發(fā)生反應(yīng)，其中已經(jīng)正式命名的塵螨過敏原組份有24組[2]。第1、2、3、9、11、14和15組塵螨過敏原與塵螨過敏患者血清特異的IgE發(fā)生反應(yīng)反應(yīng)條帶出現(xiàn)頻次和反應(yīng)強度均較高，可能是塵螨的主要過敏原成份[7]。粉塵螨基因組和轉(zhuǎn)錄組研究結(jié)果顯示，粉塵螨不含有第12組和第19組過敏原組份。Weghofer M等研究發(fā)現(xiàn)，Der p 23主要存在于螨的腸道中，具有結(jié)合幾丁質(zhì)的結(jié)構(gòu)域，可與74%的屋塵螨過敏患者IgE抗體發(fā)生結(jié)合，是屋塵螨的主要過敏原之一[8]。

本課題組多組學(xué)技術(shù)首次發(fā)現(xiàn)了粉塵螨UQCRB同源物與粉塵螨過敏患者血清IgE呈陽性反應(yīng)，進一步通過人工合成基因表達純化而獲得了重組粉塵螨UQCRB樣蛋白，并對其過敏原性予以初步鑒定，結(jié)果顯示其皮膚點刺陽性率為50%（5／10）[2]。這一新發(fā)現(xiàn)的過敏原被正式命名為第24組塵螨過敏原，即Der f 24。本研究克隆了Der f24cDNA基因并表達純化獲得了重組Der f24。通過IgE－WB實驗結(jié)果顯示，重組Der f24蛋白與粉塵螨過敏患者特異性IgE抗體結(jié)合率高達100%（10／10）；另外，IgE－ELISA 顯示其陽性反應(yīng)值／陰性反應(yīng)值（P／N值）高（圖5），說明與粉塵螨過敏患者血清特異性IgE抗體的結(jié)合能力強。這也說明了Der f24可能是粉塵螨又1個主要的過敏原成份。

本研究基于Der f24的氨基酸序列，利用SWISS－MODEL在線軟件，參考模板 （template：1PP9.F）對粉塵螨UQCRB樣蛋白3D結(jié)構(gòu)進行模擬并預(yù)測其B細胞抗原表位，選擇其中3個進行人工合成肽驗證（Epitope 1：75－88aa；Epitope 2：44－57aa；Epitope 3：104－117aa），結(jié)果均與與粉塵螨過敏性患者血清特異IgE反應(yīng)。Der f24表位的初步鑒定為下一步全面鑒定其IgE B細胞表位并明確關(guān)鍵氨基酸提供了基礎(chǔ)塵螨過敏原天然提取液中雖然有很多IgE結(jié)合蛋白，但大多不穩(wěn)定，可被內(nèi)源性蛋白酶降解，且單一過敏原組份由于含量低，很難通過這種天然提取液純化而大量獲取。重組過敏原純度高、易標準化，在臨床診斷和治療中，相比塵螨浸液提取物有一定的優(yōu)勢[9]。本研究通過原核表達純化獲得了大量高純度重組Der f24蛋白，且具有很強的結(jié)合特異性IgE活性。在目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的數(shù)百種過敏蛋白中，沒有報道過具有這一類生化功能的蛋白可以作為過敏原。這為研究過敏反應(yīng)發(fā)生的機制提供了新的線索。本研究為螨性過敏性疾病的發(fā)生機制及其診斷和治療奠定新的技術(shù)基礎(chǔ)。

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