長慶油田石油污染土壤微生物種群多樣性研究*

楊琴 張海玲 劉銳 聶麥茜

（1.中國石油長慶油田油氣工藝研究院；2.低滲透油氣田勘探開發(fā)國家工程實驗室；3.西安建筑科技大學）

長慶油田石油污染土壤微生物種群多樣性研究*

楊琴1，2張海玲1，2劉銳1，2聶麥茜3

（1.中國石油長慶油田油氣工藝研究院；2.低滲透油氣田勘探開發(fā)國家工程實驗室；3.西安建筑科技大學）

以姬塬油田井場石油污染土壤為研究對象，通過高通量測序，分析了細菌群落的類型和結構，結果顯示3份土壤樣品中共檢測到包括變形菌門、放線菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、酸桿菌門和疣微菌門等24個門的細菌，土壤微生物結構多樣性豐富，揭示了原油污染土壤的微生物種群多樣性情況，對石油污染微生物治理技術具有重要的意義。

石油污染；土壤；生物種群；高通量測序方法

0 引 言

在石油開采、加工和運輸過程中，石油及其產品進入土壤引起土壤的污染和破壞［1］。石油污染土壤修復治理困難，已成為不可忽視的環(huán)境問題［2］。

20世紀60年代，人們開始接種微生物以加快和促進有機污染物的降解，現在生物修復技術已作為原油污染土壤修復的首選措施［3］。由于研究區(qū)域油田散布于黃土塬農業(yè)區(qū)中，微生物是土壤生態(tài)系統中的重要成員［4］，而石油污染土壤中的微生物是油泥生物可降解性的重要表征參數，因此石油污染土壤中的微生物種群結構與多樣性是研究油泥微生物處理技術的理論基礎與重要的技術依據。本文以高通量分析為技術手段，對于長慶姬塬油田石油污染和未污染土壤中的細菌微生物種群進行了比較分析，揭示了其中的種群結構差異和優(yōu)勢微生物種群，為認識石油污染對土壤微生物種群特性的影響提供了基礎。

1 材料與方法

1.1 土樣采集

選擇長慶姬塬油田3個叢式井場，采用網格法在每個井場利用帶有刻度的管型取土器采集9份油污土壤樣品，充分混合成3份后封閉于密封袋中放置于-80℃的冰箱中儲存，以備后續(xù)檢測分析。

1.2 土壤細菌的16S rD N A基因測序

①土壤微生物基因組D N A提取及其16S rD N A基因的V3區(qū)片段擴增分析。

利用土壤D N A提取試劑盒（Fast D N A Spin Kit for Soil，M P Bio medicals，美國）提取16個土壤樣本的D N A（具體D N A提取步驟參考試劑盒說明書）。針對16S rD N A V3區(qū)進行聚合酶鏈式反應（PC R）預試驗，然后進行大批量P C R擴增（Herculase II Fusion D N A Poly merase，Agilent，600677B），使用的引物為：F 5′-C C T A C G G G A G G C A G C A G-3′，R5′-A T T A C C G C G G C T G C T G G-3’。P C R擴增程序如下：95℃預變性2 min；95℃變性30 s，48℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個循環(huán)；最后72℃終延伸5 min結束［5］。

②P C R產物純化與定量。

通過P C R聚合酶鏈式反應獲得不同土壤樣品細菌的P C R產物后，進行瓊脂糖凝膠電泳分析，針對目標條帶進行割膠回收，獲得純化的P C R產物（QIA Quick Gel Extraction Kit，Qiagen，28704）。利用Qubit 2.0熒光定量儀器對其定量。

③D N A雙末端修復與富集。

通過3′-5′核酸外切酶及聚合酶的共同作用，修復帶有突出末端的D N A片段。在連接酶的作用下，孵育含有標簽的接頭與D N A片段，使其相連。利用P C R選擇性地富集兩端連有接頭的D N A片段，同時擴增D N A文庫。

④驗證文庫、均一化并混合文庫、上機測序。

利用Qubit2.0熒光定量儀定量DNA（Quant-iT ds DNA HS Assay Kit，Q32851；Invitrogen），通過Agilent 2100對P C R富集片段進行電泳完成質量控制，驗證DNA文庫的片段大小及分布規(guī)律（Agilent 2100 Bioanalyzer，Agilent，2100；Agilent High Sensitivity D N A Kit，A gilent 5067-4626），多樣品D N A文庫（Multiplexed DNA libraries）均一化至10n mol/L后等體積混合，將混合好的文庫（10 n mol/L）逐步稀釋定量至26p mol/L后在Ion Torrent測序平臺上測序。

1.3 數據處理

①原始數據處理與樣本序列數目統計。

試驗采用單端測序。首先對原始數據進行質量控制，截斷或舍棄低質量序列（50個連續(xù)堿基平均質量＞25，序列長度＞50）。利用Flash軟件將通過質量控制的序列對應的兩端進行連接，舍棄無法連接的序列。根據試驗要求，對連接上的序列進行過濾（連續(xù)相同堿基＜6；模糊堿基＜1），獲得最終用于分析的序列。

②生物信息學分析。

應用Qiime（quantitative insights into microbialecology），根據序列的相似度，將序列歸為多個OTU（operational taxonomic unit）。OTU產出后，統計各個樣品含有O T U情況及每個OTU中含有序列的數目。通過尋找最近親緣物種的方法，得到每個O T U的分類學信息。選取相似度在97%條件下的O T U生成預期的稀釋曲線，并利用軟件mothur計算豐富度指數Chaol和A C E，覆蓋度指數（good’s coverage）以及多樣性指數Simpson和Shannon指數進行Alpha多樣性分析。利用Excel、P Co A、Correlation聚類法分別進行數據處理、細菌群落分布、主成分分析和聚類分析。

2 結果與分析

2.1 土壤樣本測序結果及取樣深度驗證

本研究利用高通量測序方法，共讀取4個土壤樣品中微生物16S rD N A基因序列135 453條，其中66 535條長度大于200 bp的片段經比對屬于細菌。圖1為高通量測序序列長度分布情況，經過統計得知片段長度大于200 bp的序列占序列總數的72.32%。各樣品序列測序量在28 738～38 700條之間，平均為33 863條［6］，對原始數據進行質量控制，截斷或舍棄低質量序列后各樣品有效讀數14 056～18 628條，平均為16 634。應用Qiime，根據序列的相似度，將序列歸為7 778個O T U。各樣本測序獲得的細菌O T U序列讀數如表1所示。

圖1 高通量測序序列長度分布

表1 土壤樣本測序獲得的細菌OTU讀數

在不同遺傳距離上繪制樣品的稀釋曲線，如圖2所示。該曲線表明每個樣品的取樣深度，用來確定每個樣本測序的數量是否達到飽和。從圖2（a）、（b）中可以看出，當序列較少時，隨著樣本中測序數量的增加，O T U數目劇增。隨著測序量的不斷增大，O T U數目增加趨于平緩，但仍然未達到飽和，提示樣本內仍有少量的新的微生物種類沒有被發(fā)現。Shannon多樣性指數能夠預測并比較樣本微生物種群的多樣性。盡管隨著測序量的增大，不斷有新的物種出現，但Shannon指數達到飽和，曲線趨于平緩（圖2（c）、（d））。說明本次試驗4個樣本的測序量基本能夠反映土壤樣本中細菌群落的多樣性組成。

2.2 高通量測序分析土壤菌群結構

所有66 535條序列分屬于細菌的24個門，其中主要的門包括Proteobacteria（變形菌門）、Actinobacteria（放線菌門）、Firmicutes（厚壁菌門）、Bacteroidetes（擬桿菌門）、Acidobacteria（酸桿菌門）、Verr-ucomicrobia（疣微菌門），說明土壤細菌類型豐富。

除去未確定種屬的其他菌類和相對含量小于1%的菌類，三個來自油田土樣和未污染的空白（黃土高原土樣）之間細菌組成和土壤細菌相對豐度差異較大。對比土壤細菌群落的優(yōu)勢菌群發(fā)現，四種土壤樣品細菌群落的優(yōu)勢菌群為：放線菌門+變形菌門（土塬30-103井）、變形菌門+放線菌門（#D4M）、變形菌門+擬桿菌門（沙19-19井）、變形菌門+放線菌門（空白）。土壤細菌相對豐度從大到小依次為：空白、土塬30-103、#D4M和沙19-19井。說明：長時間的石油污染對土壤菌群結構和土壤細菌相對豐度影響較大。

圖2 土壤樣本16S rDNA基因序列高通量測序的稀釋曲線

2.3 土壤樣品O T U分布Venn圖分析

將土壤樣品O T U分布進行Venn圖分析，如圖3所示。結果表明：四種土壤樣品中均有分布的O T U為11個；兩兩相比共有O T U數目最多的是空白和土塬30-103（211），最少的為沙19-19井和土塬30-103（11）；三種石油污染土樣中共有33個O T U；四種土壤樣品中獨有的O T U數從大到小依次為：土塬30-103（5 166）、#D4M（1 743）、空白（1 269）和沙19-19井（481）。說明：土壤在長期石油污染的選擇壓力下，土壤菌群結構發(fā)生明顯改變，能利用石油為碳源的菌（即石油降解菌）逐漸成為優(yōu)勢菌群；不同的地理環(huán)境、土壤理化性質及石油污染強度、時間均可影響菌群變化進程，三種石油污染土樣相比，土塬30-103土壤樣品中獨有的O T U數最多為5 166，從中分離到高效石油降解菌的可能性最大。

圖3 土壤樣品OTU分布Venn分析

2.4 土壤樣品O T U分布H eatmap圖分析

根據各樣品中O T U的分布及豐度進行聚類后進行H eatmap圖分析，如圖4所示。結果表明：土壤樣本間親緣關系，#D4M、土塬30-103和空白較近、而沙19-19井和空白較遠。這可能與樣品所處的地理環(huán)境、土壤理化性質及石油污染強度、時間有關。

圖4 土壤樣品OTU分布的Heatmap分析

3 結 論

通過高通量測序方法分析了土樣中土壤微生物的遺傳多樣性分析。共讀取到135 453條16S rD N A基因序列，其中66 535條長度大于200 bp的片段經比對屬于細菌。測序的覆蓋度均大于80%，表明測序量基本能夠反映該區(qū)域細菌群落的種類和結構。

3份土壤樣品中共檢測到包括變形菌門、放線菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、酸桿菌門和疣微菌門等24個門的細菌，土壤微生物結構多樣性豐富。土壤在長期石油污染的選擇壓力，土壤菌群結構發(fā)生明顯改變，能利用石油為碳源的菌（即石油降解菌）逐漸形成優(yōu)勢菌群，且優(yōu)勢菌群明顯成為治理石油污染土壤的高效降解菌種的潛在微生物群體。

［1］ 馬強，林愛軍，馬薇，等.土壤中總石油烴污染（T P H）的微生物降解與修復研究進展［J］.生態(tài)毒理學報，2008，3（1）：1-8.

［2］ 曹輝，郭晶，馬魁堂，等.石油污染土壤治理研究進展［J］.現代農業(yè)科技，2011（23）：309-310.

［3］ 李美玉.石油污染土壤中石油烴微生物降解性能的研究［D］.青島：中國石油大學（華東），2010.

［4］ 張清敏，劉曼，周湘婷.微生物肥料在土壤生態(tài)修復中的作用［J］.農業(yè)環(huán)境科學學報，2006（增刊）：283-284.

［5］ 李友發(fā)，宋兵，宋亞娜，等.福建省稻田土壤細菌群落的16S rD N A-PC R-D G G E分析［J］.微生物學通報，2008，35（11）：1715-1720.

［6］ 余悅.黃河三角洲原生演替中土壤微生物多樣性及其與土壤理化性質關系［D］.濟南：山東大學，2012.

10.3969/j.issn.1005-3158.2015.05.007

1005-3158（2015）05-0022-04

2015-01-12）

（編輯 王蕊）

國家自然科學基金面上項目（51278405）；陜西省國際科技合作重點項目（2012 K W-25）。

楊琴，2008年畢業(yè)于西安建筑科技大學環(huán)境科學專業(yè)，碩士，現在中國石油長慶油田油氣工藝研究院從事油氣田安全環(huán)保技術研究工作。通信地址：西安市未央區(qū)明光路長慶油田油氣工藝研究院，710018