油田采出水微生物處理菌株選育及特性研究*

杜茂林 谷亞楠 付瑞敏 陳五嶺

（1.西北大學生命科學學院；2.河南教育學院人口與生命科學系）

油田采出水微生物處理菌株選育及特性研究*

杜茂林1谷亞楠1付瑞敏2陳五嶺1

（1.西北大學生命科學學院；2.河南教育學院人口與生命科學系）

為解決油田采出水微生物處理菌株的應用局限，通過H e-Ne激光和紫外線復合誘變，選育出能夠在油田采出水中快速生長，并有效降解油田采出水主要危害成分的5種優勢菌株。經形態學和生理生化鑒定，這5株菌分別為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、醋酸鈣不動桿菌（Acinetobacter calcoaceticus）、多食鞘氨醇桿菌（Sphingobacterium multivoru m）、熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）和解脂假絲酵母（Candida tropicalis）。經檢驗，所篩選的菌株均能降解石油烴類以及聚丙烯酰胺類物質，并對高堿、高溫環境有一定耐受性，可將其直接應用于油田采出水的處理。

油田采出水；微生物處理；菌株選育；降解特性

0 引 言

微生物處理技術是通過微生物新陳代謝的生理生化過程來降解油田采出水中的主要危害成分，包括石油烴類、懸浮物等，并促使其轉化為自身可利用的無毒無害成分，進而達到去除采出水主要污染物的目的［1-3］。微生物水處理技術已經在城市污水廠和工業污水處理中得到了廣泛的應用，近年來，各大油田逐步推廣使用。但目前多采用的單一菌種處理含有多組分有機物時普遍存在生化反應器處理量小，不同油井采出水成分差異大，采出水溫度高等制約因素。因此利用現代微生物技術開發能夠在同一生化反應器中同時降解各類油田污水主要污染物的復合微生物菌劑，并能克服采出水高溫、高堿的環境，提高其對不同水型、不同礦化度采出水的適應性具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 采出水樣品

采出水樣品取自國內主要油田（大慶油田、長慶油田、新疆油田、遼河油田、中原油田）不同處理站采出水樣品各3份，樣品取回后置于冰箱4℃保存。

1.1.2 試劑

配置微生物分離純化常用培養基所需試劑及提取、檢測用試劑，上述試劑皆為分析純。

1.1.3 培養基

細菌、放線菌、酵母菌、霉菌斜面以及分離用常規培養基；

富集液體培養基：采出水（樣品編號O W1-2）15%，K2H P O4·3 H2O 1.0%，NaCl 0.5%，K H2P O40.4%，NaN O30.2%，（N H4）2SO40.1%，M gSO4·7 H2O 0.025%，p H值調至8.0；

油田采出水平板培養基：油田采出水，2%瓊脂；

石油烴類降解用培養基（g/L）：Na H2P O4·H2O 1.0，K H2P O41.0，NaN O30.5，（N H4）2S O40.5，CaCl20.02，M gS O40.2，原油0.1，p H值調至7.0；

聚合物降解用培養基：常規液體培養基中加入聚丙烯酰胺至最終濃度為1 g/L。

1.2 檢測方法

活菌數檢測：血球板計數法、活菌平板菌落計數法；

p H值測定：p H值用p H S-25數顯p H計測定；

石油烴類總量測定［4］：紅外光譜法；

懸浮物含量的測定［5］：濁度儀測定法；

聚合物類物質降解率檢測［6］：以聚丙烯酰胺降解率為指標，采用淀粉-碘化鎘法測定。

1.3 菌株初篩

取采出水樣品各1 m L分別加入到裝有49 m L富集培養基的搖瓶中，25～35℃下，180 r/min培養48 h，檢測總菌數的變化。當菌濃度達到1.0×107cfu/m L左右時，即可利用富集固體培養基（富集液體培養基+2%瓊脂）平板涂布法分離純化。將0.1 m L分離純化菌株制成的菌懸液涂布到采出水平板培養基，28～35℃恒溫培養48 h，選擇能夠迅速生長的菌株制成菌懸液，重復三次采出水平板培養基培養馴化。選擇在采出水平板培養基上生長良好的菌株接入采出水樣品O W1-2中，35℃下180 r/min培養72 h，檢測采出水中微生物的菌體數、p H值、懸浮物含量和石油烴類含量。分離保存在采出水中生長迅速、對主要危害成分改變較大的菌株作為初篩菌株。

1.4 H e-Ne激光、紫外線復合誘變

利用分離純化的初篩菌株制備n×108cfu/m L的菌懸液，取10 m L于無菌培養皿中，紫外燈下（15 W，30 cm）誘變90 s，取誘變后菌液0.4 m L于小試管中H e-Ne激光（15 m W，15 cm）輻照10 min，紅燈下取復合誘變后的各類菌懸液0.1 m L涂布于采出水平板培養基，28～35℃恒溫培養48 h。重復三次培養馴化，挑選在采出水平板上長勢良好的菌株進行復篩［7］。

1.5 菌株復篩

將誘變后選育出的優勢菌株活化后接入1 L油田采出水樣品O W1-2中，35℃下180 r/min培養72 h，檢測采出水中微生物的菌體數、p H值、懸浮物以及石油烴類含量，確定各菌株在采出水中的繁殖生長狀況。將繁殖生長迅速、對采出水污染主要指標改變較大的菌株逐一挑選出來，分離純化后保存待用。

1.6 菌株鑒定

1.6.1 形態學鑒定

細菌的形態學鑒定參照《常見細菌系統鑒定手冊》［8］，培養24 h后觀察菌落形態，進行革蘭氏染色、結晶紫簡單莢膜染色、類脂粒染色、鞭毛染色、異染粒染色、芽孢染色、伴孢晶體染色和抗酸染色，并在顯微鏡下觀察細胞大小、形態、排列方式及特殊構造。真菌參照《真菌鑒定手冊》，載片培養48 h后顯微鏡觀察菌絲及孢子形態特征，并觀察菌落形態。

1.6.2 生理生化鑒定

利用bioMerieux公司全自動微生物分析儀（Vitek 2 Compact）及其配套的鑒定卡對上述選育出的菌株進行生理生化特性的鑒定。

1.7 所選菌株特性研究

1.7.1 菌株對石油烴類物質降解特性

將活化后的菌株轉接至石油降解液體培養基中，28～35℃下180 r/min，搖瓶振蕩培養72 h，利用超臨界流體萃取（SF E）技術提取培養液中的原油，紅外光譜法測定原油含量。降解率用菌株降解前后原油含量變化表示，計算平均降解率。

1.7.2 菌株對聚合物類物質的降解特性

將所選菌株分別接種至加有1 g/L聚丙烯酰胺的液體培養基中，以不添加聚丙烯酰胺的液體培養基為對照，28～35℃下180 r/min恒溫培養72 h，淀粉-碘化鎘法測定培養液中聚丙烯酰胺濃度，根據降解率確定菌株降解能力。

1.7.3 菌株的耐堿性研究

挑取活化好的菌株，分別接種于利用NaO H溶液調節p H值為7.5，8.0，8.5，9.0，9.5，10，10.5，11，11.5，12的液體培養基中，以不添加NaO H的培養基為對照，在28～35℃下180 r/min恒溫培養72 h，菌株耐堿能力通過實驗組和對照組活菌計數結果一致和培養液p H值變化的方式來確定。

1.7.4 菌株對溫度的耐受性

將所選菌株活化后分別接種于各類菌液體培養基，置于10，20，30，40，50，60℃，180 r/min，培養48 h，根據活菌濃度確定復篩菌株對溫度的耐受性。

2 結果與分析

2.1 采出水主要有害成分檢測

對各油田采出水的主要有害成分如石油烴類、懸浮物含量以及p H值進行測定。

各油田采出水主要有害成分檢測見表1。

表1 各油田采出水主要有害成分檢測

由表1可知，同一油田采出水樣品石油烴類含量、懸浮物含量以及p H值差異不大，不同油田的采出水主要污染物含量差異顯著。各油田未經處理的采出水均沒有達到行業S Y/T 5329—2012［9］，G B/T 18918—2002［10］采出水回注、排放控制標準。

2.2 初篩菌株

將經過富集培養、分離純化以及通過采出水平板培養馴化的12株菌分別接入1 L采出水樣品中培養，處理后采出水各項性能指標如表2所示。

表2 初篩菌株在油田采出水中培養各項性能指標分析

2.3 H e-Ne激光、紫外線復合誘變菌株復篩

初篩菌株的生長繁殖速率無法達到油田采出水微生物處理技術實際應用過程中對菌數的要求，通過應用H e-Ne激光、紫外線復合誘變技術可大幅度提高菌株在采出水中的各項生長性能指標。復合誘變后的菌株經復篩接入1 L采出水樣品中各項指標變化如表3所示。

表3 復篩菌株在油田采出水中培養各項性能指標分析

初篩菌株通過復合誘變在利用油田采出水作為唯一營養源的條件下，菌株生長繁殖能力顯著提升，菌體濃度最大可達n×109cfu/m L（n為自然數1～9），基本上達到菌株選育預期目的。

綜合以上各項指標考慮，最終確定將菌株P w1、P w2、P w4、P w6和P w11應用于油田采出水的微生物處理。

2.4 菌株鑒定

2.4.1 形態學鑒定

參照《常見細菌系統鑒定手冊》和《真菌鑒定手冊》形態學鑒定結果為：

①P w1菌落表面粗糙不透明，微白色或微黃色，無莢膜，周生鞭毛，能運動。（0.5～2.5）×（1.2～10）μm，革蘭氏陽性，芽孢為橢圓或柱狀，位于菌體中央或稍偏。

②P w2菌落白色或微黃色，邊緣不規則，較黏稠，有光澤。（0.9～1.6）×（1.5～2.5）μm，革蘭氏陰性，無芽孢，桿狀，成對或成束排列，不運動，有莢膜。

③P w4菌落乳白色、呈圓形，凸起，邊緣整齊。（0.8～1.0）×（2～3）μm，革蘭氏陰性，菌體在放大400倍的顯微觀察下呈梭棒形。

④P w6經L B瓊脂培養基培養，菌落為圓形、邊緣不完整、不透明、表面光滑。（0.3～0.5）×（0.4～1）μm，革蘭氏陰性，無芽孢、極生鞭毛。

⑤P w11血瓊脂培養基上菌落中等大小呈暗灰色。12×20μm，菌體成圓形或橢圓形，芽殖，具有橫隔的真菌絲或假菌絲，在菌絲頂端或中間有單個或成雙的芽生孢子。

2.4.2 生理生化特征鑒定

利用全自動微生物分析儀檢測菌株生理生化特性，菌株分析結果如表4所示。

表4 Vitek 2生理生化鑒定結果

菌株P w1與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的相似性為97%，菌株P w2與醋酸鈣不動桿菌（Acinetobacter calcoaceticus）的相似性為95%，菌株P w4與多食鞘氨醇桿菌（Sphingobacteriu m m ultivoru m）有91%相似性，菌株P w6與熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）有94%的相似性，菌株P w11與解脂假絲酵母（Candida tropicalis）的相似性為97%，均為非常好的鑒定。

2.5 菌株降解特性

2.5.1 菌株對石油烴類降解特性

根據已有資料報道及采出水樣品分析結果，石油污染物是油井采出水污染主要有害成分［11］，因此，考察了所選菌株降解石油烴類的能力，結果如圖1，所篩選菌株對石油烴類降解率最高為P w1可達78%，平均降解率近70%。

圖1 菌株對石油烴類及聚丙烯酰胺的降解

2.5.2 菌株對聚合物類物質的降解實驗

油田采出水中的懸浮成分和膠體構成極為復雜，經研究發現其中最難以降解，含量最高的成分是聚丙烯酰胺類物質［12-13］。因此通過考察菌株對聚丙烯酰胺的降解來衡量其對聚合物類物質的降解能力，結果如圖1所示。菌株對聚丙烯酰胺均有一定降解能力且不同菌株差異顯著，其中菌株P w6對聚丙烯酰胺降解率最高，可達57%。

2.5.3 菌株耐堿性試驗

資料顯示，各油田采出水p H值通常高達8～12。高堿性環境使得菌體內酶的活性降低，進而影響微生物細胞內的生物化學過程，甚至破壞微生物細胞，直接阻礙了微生物的生長繁殖。因此，考察了所選菌株對高堿性環境的耐受能力，結果如表5所示。

表5 菌株耐堿性實驗

結果表明：選育出的5株菌均對高堿環境具有耐受能力，其中以P w1、P w6耐受能力最強，最高耐受p H值可達9.5。

2.5.4 菌株對溫度的耐受性

油田采出水溫度通常在40℃以上，一般微生物很難在這一溫度范圍內快速繁殖，因此選育耐高溫菌株是微生物處理油井采出水的關鍵。菌株對溫度的耐受性見圖2。

圖2 菌株對溫度的耐受性

由圖2可看出所篩選的五株菌中的細菌P w1、P w2、P w4、P w6最適生長溫度均高于40℃，其中，真菌P w11在40℃時菌濃度高于7×109cfu/L，可以直接應用到油田采出水處理中。

3 討 論

①芽孢桿菌屬的某些細菌能夠較好的降解轉化和利用石油烴類、芳烴、酚類、有機氮化合物和瀝青質等有機污染物，尤其對瀝青質有較強的降解能力，同時可產生揮發性有機酸、脂肪酸、醚、酮、酯、生物表面活性劑等多種次級代謝產物［14］。

②不動桿菌屬具有較強的降低原油表面張力和分解乳化的能力并能夠降解利用長鏈烷烴、多環芳烴、酚類等。有報道自煉油廠污水中分離的醋酸鈣不動桿菌能夠以苯酚為生長所需的唯一碳源，具有高效降解苯酚、苯甲酸和鄰苯二酚等的能力，在生物修復石油污染的環境中具有較大的應用前景［15］。

③鞘氨醇桿菌屬的細菌多含有與多環芳烴（P A H s）降解有關的雙加氧酶系統，能較好的利用P A H s，在多環芳烴的遷移轉化乃至最終從環境中消失的過程中具有重要地位。其中多食鞘氨醇桿菌能夠利用共代謝途徑降解氯氰菊酯以及五氯酚、酰胺類除草劑等。其產生的生物絮凝劑和生物表面活性劑與人工合成的表活劑和絮凝劑相比效率更高、分解性更強，而且無毒無害，不會造成二次污染［16-17］。

④假單胞菌屬細菌具有在各類惡劣環境中降解轉化利用多達100種以上有機污染物的突出特點，并能分解利用一些特殊有機污染物，如石油烴類、甲醛、酚、汞化合物，乃至于六六六、D D T等有毒物質，是目前正被廣泛應用于各類污染物污染環境修復的一類細菌［18］。

⑤假絲酵母屬多數能夠利用原油餾分中的正烷烴、正烯烴及環烷烴等碳氫化合物作為生長所需的碳源。研究指出解脂假絲酵母通過產生脂蛋白類乳化劑，將采出水中的烴類化合物乳化成油水充分混合的小液滴，可直接供菌體生長和代謝所利用。假絲酵母屬多被用于重金屬、農藥、石油和酞酸脂污染的環境修復過程中［19］。

上述菌株均具有能在惡劣環境中生長繁殖和降解轉化油田主要有害物質的能力。但是，由于單一微生物對于復合污染物的降解能力有限，未來將著重研究各類菌的互利生長、協同降解的培養工藝條件，來進一步提高油田采出水中復合污染物的降解效果。

4 結 論

①利用現代微生物學育種技術，通過初篩、復合誘變以及復篩選育了5株能夠在油田采出水中快速大量生長繁殖并能高效降解油田采出水中主要有害污染物的微生物菌株。

②通過形態學、生理生化技術鑒定這5株菌分別為：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、醋酸鈣不動桿菌（Acinetobacter calcoaceticus）、多食鞘氨醇桿菌（Sphingobacterium multivorum）、熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）、解脂假絲酵母（Candida tropicalis）。

③選育的5株菌對石油烴類、聚丙烯酰胺具有較強的降解能力，對高堿環境有一定的耐受能力，且最適生長溫度在40℃左右，可直接應用于油田采出水處理。

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10.3969/j.issn.1005-3158.2015.05.008

1005-3158（2015）05-0026-05

2014-12-15）

（編輯 李娟）

陜西省重大科技創新項目，編號2009Z K C04-16。

杜茂林，西北大學生命科學學院微生物學專業，在讀碩士研究生，主要從事油氣田鉆井廢棄液以及含油污水的微生物無害化處置技術研究。通信地址：陜西省西安市碑林區太白北路229號，710069