黃山花楸成熟合子胚的萌發(fā)及愈傷組織的誘導(dǎo)

李曉毓，吳蘭平，王鳳英

（黃山學(xué)院 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，安徽 黃山245041）

黃山花楸 (Sorbus amabilis) 隸屬薔薇科(Rosaceae)花楸屬(SorbusL.)落葉喬木,兼具觀賞、藥用、經(jīng)濟(jì)價(jià)值的第三紀(jì)古老孑遺樹種。黃山花楸自然繁殖能力弱，天然更新能力差，分布范圍和數(shù)量日益減少，現(xiàn)我國(guó)僅分布于華東地區(qū)的皖南以及浙、鄂、閩等省700-1500m 中山地帶以及1500m 以上的高山地帶，已處于瀕危境地, 被國(guó)家列為三級(jí)珍稀瀕危保護(hù)植物[1]。

為保護(hù)這一珍稀物種的種質(zhì)資源和進(jìn)一步對(duì)其開發(fā)利用, 前人通過組織培養(yǎng)在花楸屬其他種進(jìn)行了一些探索和研究，及華等[2]以黑果腺肋花楸的莖尖、莖段為材料摸索出了不定芽誘導(dǎo)、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、馴化及移栽的適宜條件；安潔等[3]以石灰花楸帶芽莖段為試驗(yàn)材料, 研究了適宜石灰花楸的芽啟動(dòng)培養(yǎng)基、最佳繼代培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基。有關(guān)黃山花楸的組織培養(yǎng)及快速繁殖研究至今仍為空白。本實(shí)驗(yàn)研究了基本培養(yǎng)基、植物激素因素對(duì)黃山花楸愈傷組織的誘導(dǎo)的影響, 為建立黃山花楸組織快繁體系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 外植體的選取和處理

黃山花楸果實(shí)于10月下旬采自安徽省黃山風(fēng)景區(qū)天海景區(qū)(海拔1700-1800m)，選擇生長(zhǎng)健壯、無病蟲害的母株進(jìn)行采種。采摘下來的黃山花楸果實(shí)在水中浸泡后搓洗，去掉果皮和果肉，多次沖洗去雜得到純凈種子,室溫自然干燥，剔除雜質(zhì)和空粒,挑選出飽滿種子，置于4℃冰箱黑暗處理24h 待用。

1.2 外植體的滅菌和接種

低溫干藏處理后的花楸種子用75%的酒精消毒20 秒，用無菌水沖洗3 次，再用0.05%升汞對(duì)種子滅菌3 分鐘，無菌水沖洗6 次，之后將種子放在墊有濾紙的培養(yǎng)皿中，在種子子葉端用手術(shù)刀切割一個(gè)0.5cm 左右的小口，從切口處小心將種胚擠出，將剝離好的白色飽滿種胚接種于MS 基本培養(yǎng)基上。

1.3 愈傷組織的誘導(dǎo)

本實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)基MS 基礎(chǔ)培養(yǎng)基，蔗糖30g/L，瓊脂6g/L，PH5.8-6.0。添加不同激素組合分別進(jìn)行誘愈，激素組合如下：第一組：MS+NAA(0.1，0.2，0.3mg/L)； 第二組：MS+6-BA(1，2，3mg/L)；第三組 ：MS +NAA (0.1，0.2，0.3mg/L） +6 -BA(1，2，3mg/L)。

1.4 培養(yǎng)條件

將接種在MS 培養(yǎng)基的成熟合子胚避光處理72h，之后光照16h，黑暗8h,光照強(qiáng)度為2000lx 左右,溫度為(22±2)℃，濕度約70-80%。接種在添加不同激素的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上的成熟合子胚，培養(yǎng)條件同上。

1.5 觀察與統(tǒng)計(jì)方法

成熟合子胚在MS 培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 天統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率，合子胚的子葉接種至不同的誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)20天后，統(tǒng)計(jì)出愈率：

萌發(fā)率（%）=（萌發(fā)數(shù)）/接種的種胚數(shù)

出愈率（%）=（產(chǎn)生愈傷組織的種胚數(shù)）/接種的種胚數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 種皮對(duì)花楸種子萌發(fā)的影響

黃山花楸果實(shí)為球形小梨果,果皮光滑，種子長(zhǎng)卵形,背面隆起,種皮黃褐色,長(zhǎng)度2.30-3.10mm,平均長(zhǎng)2.80mm,寬1.32-1.80mm,平均寬1.50mm。成熟種子由種皮和胚兩部分組成，解剖鏡下觀察黃山花楸種胚形態(tài)發(fā)育完全,成熟胚具有兩片肥厚的子葉、圓柱形胚根，胚芽、胚軸等不明顯。

成熟合子胚在MS 培養(yǎng)基上培養(yǎng)5d 后兩片子葉展開，胚軸伸長(zhǎng)彎曲，8d 左右長(zhǎng)出真葉，20d 后長(zhǎng)成單株無菌苗。對(duì)照完整種子30d 無萌發(fā)現(xiàn)象，證明胚本身不存在休眠，且萌發(fā)能力很強(qiáng)，子葉中不存在明顯的萌發(fā)抑制物質(zhì)，種子休眠主要是由于胚外環(huán)境——種皮造成的。

2.2 激素濃度對(duì)成熟合子胚愈傷組織誘導(dǎo)的影響

成熟合子胚分別接種于第一、二、三組誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。接種5d 后, 可明顯看到胚明顯膨大變厚，15d 后,合子胚的子葉和下胚軸均開始愈傷化，出現(xiàn)淡綠色或淡黃色的愈傷組織，上面布滿細(xì)小顆粒狀突起，分布緊湊。不同激素配比的培養(yǎng)基都可以誘導(dǎo)愈傷組織，但愈傷組織出愈率存在差別，見表1。

表1 不同激素組合對(duì)黃山花楸愈傷誘導(dǎo)的影響

觀察統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn):6-BA 為1.0mg/L，NAA 為0.1mg/L 時(shí)，愈傷組織的誘導(dǎo)率達(dá)100%，優(yōu)于其他組合，推測(cè)6-BA 和NAA 共同誘導(dǎo)愈傷組織。隨著NAA 濃度的增高, 合子胚愈傷出愈率下降，推測(cè)低濃度的NAA 對(duì)黃山花楸愈傷誘導(dǎo)有促進(jìn)作用。

3 結(jié) 論

1.黃山花楸休眠主要是由于種皮機(jī)械障礙造成的物理休眠，去掉種皮后可以生成完整的無菌苗。種子休眠歸納為種皮束縛性休眠和種胚性休眠，其中種皮束縛性休眠種子的種胚取出后，就不再休眠[4]。黃山花楸未處理的完整種子不能萌發(fā), 去掉種皮將種胚剝離出來后可以萌發(fā)，并長(zhǎng)成完整的無菌植株，表明黃山花楸種子休眠主要是由于種皮機(jī)械障礙造成的物理休眠。休眠解除應(yīng)選擇針對(duì)種皮而非種胚的處理方式，如種皮酸堿腐蝕、熱水浸種、機(jī)械劃傷、混沙層積等方法[5,6]來進(jìn)行打破休眠的研究。

2.黃山花楸成熟合子胚在添加不同激素組合的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上均可誘導(dǎo)愈傷組織，激素濃度不同，愈傷誘導(dǎo)率存在差異，最佳誘愈培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，成熟合子胚的愈傷組織誘導(dǎo)相對(duì)比較容易，這為今后開展黃山花楸成熟合子胚體細(xì)胞胚胎發(fā)生以及植株再生等方面的探索奠定了良好基礎(chǔ)，但是在培養(yǎng)過程中如何控制愈傷組織的分化和不定芽的增殖以得到質(zhì)好量大的芽，并且保證植株成苗率高等研究還需逐步開展。

[1]洪嵐.珍貴的高山觀賞樹種—黃山花楸[J].植物雜志,2002(1):18-18.

[2]及華,張紅梅,張海新.黑果腺肋花楸的組織培養(yǎng)和快速繁殖[J].植物學(xué)通訊,2004,40（1）:67-67.

[3]安潔.石灰花楸的組織培養(yǎng)技術(shù)體系研究[D].成都：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004:49.

[4]Bewley J D.種子的發(fā)芽和休眠[J].種子,2002(6):84-86.

[5]陳昕,曹珊珊,張紅星.黃山花楸種子休眠影響因素[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2010,38（7）:5-7.

[6]魚小軍,王芳,龍瑞軍.破除種子休眠方法研究進(jìn)展[J].種子,2005,24(7):46-49.