單核苷酸多態性與華法林初始抗凝療效和維持劑量的研究

吳 炯， 李 軍， 鄔升超， 張春燕， 宋斌斌， 王蓓麗， 郭 瑋， 潘柏申

(1.上海復旦大學醫學院附屬中山醫院檢驗科，上海200032;2.上海復旦大學醫學院附屬中山醫院心外科，上海200032)

華法林是臨床上防治靜脈和動脈血栓栓塞疾病廣泛使用的口服抗凝藥物，主要針對有房顫、心臟瓣膜置換、深靜脈血栓以及肺栓塞患者。患者通過檢測血液國際標準化比值(international normalized ratio，INR)，以 INR 是否進入 1.8～3.0的有效治療范圍來判斷華法林抗凝治療是否療效。華法林本身狹窄的治療窗以及個體代謝能力的差異導致抗凝不足或抗凝過量等問題一直無法得到很好的解決。

眾多研究表明基因及非基因因素(種族、年齡、體重、胺碘酮等)共同對患者所需華法林劑量產生影響。基因因素公認與個體間華法林抗凝療效存在顯著相關性［1-5］，包括華法林體內代謝與藥物作用靶點相關基因(CYP2C9和VKORC1)以及維生素K1代謝循環中相關酶類的活性改變的相關基因(GGCX、EPHX1和 CYP4F2)［6-8］。我們通過選取不同的2組人群，研究包括 CYP2C9、VKORC1、GGCX、EPHX1、CYP4F2 在內的5 個基因共9個單核苷酸多態性位點對華法林初始抗凝療效和維持劑量的影響，為臨床上更安全、有效地使用華法林提供依據。

材料和方法

一、對象

1.初始抗凝療效組 選取2012年10月至2013年3月在上海復旦大學附屬中山醫院心臟外科病區進行心臟瓣膜置換手術的漢族患者212例，其中男106例、女106例，年齡(53±13)歲。入組患者需滿足以下條件:18周歲以上、心臟瓣膜置換術后即開始服用華法林、基礎INR≤1.4、目標INR在1.8～3.0之間。同時臨床醫生均在對患者基因型不知情的情況下進行抗凝治療，首劑量為2.5～3.75 mg(2.5 mg/片，華法林鈉片)之間，之后根據INR的檢測結果進行劑量調整。

2.維持劑量組 選取2012年10月至2013年3月在上海復旦大學附屬中山醫院就診的漢族患者266例，其中男146例、女120例，年齡(61±14)歲。入選患者中房顫78例、心臟瓣膜置換120例、肺栓塞36例、深靜脈血栓12例。所有患者均服用華法林3個月以上，通過調整達到穩定服藥劑量(相隔7 d，2次INR檢測結果均在1.8～3.0之間)。

上述兩組患者均無既往肝腎疾病史，除胺碘酮外不服用其它會影響華法林藥效的藥物，如阿司匹林、氯吡格雷、肝素及維生素K等。

二、方法

1.標本和基本信息采集 (1)初始抗凝療效組:在患者完成心臟瓣膜置換手術后，采用乙二胺四乙酸二鉀(ethlene diamine tetraacetic acid-K2，EDTA-K2)抗凝管采集患者血液標本，通過查閱電子病歷記錄患者術后4 d內的基本信息，包括每日服用華法林劑量(mg)、每日INR檢測結果、是否使用胺碘酮，3 d引流總量(mL)等;(2)維持劑量組:入組患者按要求于門診隨訪時采用EDTA-K2抗凝管采集患者血液標本，同時記錄近期INR檢查情況、達到穩定狀態后華法林劑量以及其它合并藥物的使用情況。將采集的血液樣本分裝后置于－20℃保存。

2.基因組DNA抽提 使用基因組DNA抽提試劑盒提取基因組DNA，按照試劑盒提供說明書操作，測定DNA含量。

3.基因分型 使用Primer Premier 5.0軟件針對 CYP2C9(rs1799853、rs1057910)、VKORC1(rs9923231)、CYP4F2(rs2108622)、GGCX(rs12714145)、EPHX1(rs1877724、rs2292566、rs4653436)基因位點設計引物，引物序列見表1，由上海生工生物工程有限公司合成引物。聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)擴增體系:上下游引物各 0.5 μL(10 μmol/L)、DNA 模板 4 μL(100～120 ng)、Premix TaqTMHot Start Version(TaKaRa)10 μL、去離子水5μL，反應總體積20μL。循環參數:95℃預變性5 min，94 ℃變性30 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，40個循環后72℃再延伸2 min。以2%瓊脂糖凝膠電泳進行擴增片段長度驗證，見圖1。由華大基因科技股份有限公司進行測序，以Chromas軟件判讀基因型，見圖2。

圖1 PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳

表1 華法林相關基因引物序列表

圖2 測序法基因分型結果

4.觀察指標的設定 患者服用華法林后的目標INR范圍定義“有效治療范圍”(1.8～3)。(1)初始抗凝療效組:設定初始抗凝療效觀測期為4 d。我們認為患者在以基本相同的經驗性給藥方式下進行抗凝治療，在觀測期結束時INR的結果與初始INR的差值可以反映初始抗凝的療效，因此我們將該差值以△INR4-1表示。同時還設定了其它觀測指標，包括首日服藥后INR檢測結果與初始INR值的差，以△INR2-1表示;INR進入治療窗的例數;INR＞3的例數;INR＞4的例數;出血事件;(2)維持劑量組:將“達到穩定狀態”定義為相隔7 d以上，在服用相同劑量華法林的情況下，2次INR檢測結果均在治療窗內，則該劑量即為患者華法林維持劑量。

三、統計學方法

采用SPSS17.0軟件進行統計分析。使用卡方檢驗判斷各SNPs的等位基因頻率和基因型頻率是否符合Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05)。正態分布的數據以±s表示，非正態分布的數據以中位數(四分位數間距)表示。非正態分布的數據如維持劑量，使用自然對數進行變換。采用Kolmogorov-Smirnov檢驗驗證數據的正態性。符合正態分布的數據，如Ln(維持劑量)、體重、體表面積(body surface area，BSA)和年齡等以兩獨立樣本t檢驗比較兩組間的差異，以單因素方差分析比較多組間的差異。非正態分布的數據，如△INR4-1，2組間比較采用Mann-Whitney非參數檢驗。連續變量之間的相關性采用Pearson相關分析進行檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、初始劑量組基本資料及初始抗凝療效

初始劑量組共入組212例心臟瓣膜置換患者基本資料見表2。根據△INR4-1的結果，將其進行四分位分組后觀察影響因素。基因因素中CYP2C9(rs1057910)、VKORC1(rs9923231)及EPHX1(rs2292566)對△INR4-1有明顯影響(P＜0.05)。CYP2C9(rs1057910)和 EPHX1(rs2292566)對三日內INR是否進入治療范圍有明顯影響(P＜0.001、P＜0.05)。見表3。

篩選得到的基因 CYP2C9(rs1057910)、VKORC1(rs9923231)和 EPHX1(rs2292566)進一步分析顯示，CYP2C9(rs1057910)AC/CC型患者的△INR4-1［中位數(四分位間距)］為1.10(0.87～1.41)，明顯高于 AA 型患者［0.69(0.30～1.05)］(P＜0.05)。VKORC1(rs9923231)AA 型患者的△INR4-1為0.81(0.45～1.25)，明顯高于GA 型患者［0.31(0.12～0.75)］，P＜0.05。EPHX1(rs2292566)GA/AA型患者的△INR4-1為0.84(0.45～1.22)，明顯高于 GG 型患者［0.63(0.27～0.97)］(P＜0.05)。見表4。

根據CYP2C9(rs1057910)，VKORC1(rs9923231)和EPHX1(rs2292566)的基因型分組。結果顯示CYP2C9基因AC/CC型患者服藥3 d后INR進入治療范圍(1.8～3.0)的例數明顯高于CYP2C9基因AA型(P＜0.05)，且并不受VKORC1基因型的影響。CYP2C9基因AA型和VKORC1基因AA型、EPHX1基因GA/AA型患者服藥3 d后INR進入治療范圍(1.8～3.0)的例數明顯高于EPHX1基因GG型(P＜0.05)。見表5。

二、維持劑量組基本資料及維持劑量的研究

維持劑量組的患者基本資料見表2。平均每日華法林劑量為(3.01±1.05)mg，每日服用最高劑量為6.88 mg，最低為0.83 mg;平均每周華法林劑量為(21.02±7.45)mg，每周服用最高劑量為48.13 mg，最低為5.78 mg。

表2 入組患者基本信息

表3 初始療效相關基因因素篩選

表4 不同基因型間的影響因素分析

表5 不同基因型間的終點事件的差異

CYP2C9(rs1057910)及VKORC1(rs9923231)之間每日華法林劑量及每周華法林劑量存在明顯差異。非基因因素中，房顫患者華法林維持劑量為(2.91±0.88)mg/d、心臟瓣膜置換患者為(3.03±1.11)mg/d、肺栓塞患者為(3.27±1.42)mg/d、深靜脈血栓患者為(2.86±0.61)mg/d，單因素方差分析顯示不同病因組間華法林維持劑量差異無統計學意義(P＜0.05)。單因素統計結果顯示胺碘酮、體重、BSA、年齡吸煙、飲酒、糖尿病和性別均與維持劑量不相關。見表6。

表6 華法林相關基因不同基因型間每日及每周華法林劑量的比較

討 論

口服抗凝藥物華法林廣泛用于臨床，主要面向靜脈和動脈血栓栓塞疾病患者。但由于華法林個體間的劑量差異較大，受年齡、體重、相關基因多態性、其它藥物使用和飲食習慣等的影響。近年來，對于華法林藥物基因組學的研究主要關注初始抗凝治療階段和維持劑量。初始抗凝階段研究中所涉及的基因主要以CYP2C9和VKORC1為主［3-5］，而針對維持劑量的研究除和華法林代謝和作用相關的基因外，還包含與維生素K1體內循環和代謝相關的基因如CYP4F2、GGCX和EPHX1等［6-8］。大多數研究均以非中國人群為研究對象。眾多研究均顯示基因突變的頻率存在顯著的種族差異，因此需要研究多基因對中國漢族人群在華法林初始抗凝療效和維持劑量的影響。

本研究包括初始抗凝療效和維持劑量兩方面。針對初始抗凝療效，國內學者主要研究的是CYP2C9和 VKORC1［4-5］。但除上述 2個基因以外，我們還對CYP4F2、GGCX和EPHX1這3個基因共5個SNPs位點對初始抗凝療效的影響進行了研究。同時還設定了初始抗凝療效觀測指標“△INR4-1”，通過該觀測指標對所得數據的統計和分析，得到在各基因組基礎INR均值均＜1.2的 前 提 下，CYP2C9(rs1057910)、VKORC1(rs9923231)和EPHX1(rs2292566)均與初始抗凝療效顯著相關。文獻報道CYP2C9和初始抗凝治療中發生的抗凝過度事件有關［9-10］。本研究中雖然INR＞3的患者有18例，INR＞4的患者有4例，但結果顯示CYP2C9(rs1057910)并不與初始抗凝期內發生抗凝過度的事件顯著相關。這可能與我們僅研究初始3 d的抗凝療效，觀察期較短有關。另外，本研究群體首日劑量在2.5～3.75 mg之間，之后根據INR的檢測結果調整劑量。結果顯示該華法林初始給藥方式能使得大部分CYP2C9(rs1057910)AC/CC型患者在3日內INR進入有效治療范圍，而對于CYP2C9(rs1057910)AA型患者尚無法使得患者INR在3 d內進入有效治療范圍內。由于CYP2C9(rs1057910)在中國漢族人群的等位基因突變頻率為4%［4～5，10］，在本研究中為4.54%，所占比例很低。因此本研究群體中的大部分患者在目前的給藥方式下無法盡快進入有效治療范圍內。

在維持劑量的研究中，研究對象均服用3個月以上的華法林，期間多次根據INR檢測結果對劑量進行調整后，得到了個性化的維持劑量。研究發現CYP2C9和VKORC1的基因型對于維持劑量均存在顯著影響，CYP2C9(rs1057910)AC/CC型患者維持劑量更低，而VKORC1(rs9923231)GA型患者維持劑量更高，這與之前許多國內外學者的研究結果［7，12-13］相一致。GU 等［7］在以中國漢族人群為對象，對華法林維持劑量的研究中發現EPHX1(rs4653436)攜帶“G”等位基因的患者需要更低的華法林維持劑量［GG、AG:(1.8±0.6)mg/d，AA:(2.2±1.1)mg/d，P＜0.05］，但該結果并沒有在研究中得以體現。CEN等［6］對CYP4F2 rs2108622在中國人群的分布以及對于華法林維持劑量的影響進行了研究，結果顯示CC型患者其維持劑量為(2.9±1.1)mg/d，明顯低于CT型和 TT 型患者［(3.2±1.1)mg/d，P＜0.05］。此結論在本研究中并沒有重現。HUANG等［8］同樣針對中國漢族人群研究GGCX 3261對華法林維持劑量的貢獻，發現GGCX3261 GG型和AA型2組間維持劑量存在明顯差異(P＜0.05)。而在研究中雖然GG型所需劑量要比AA型低0.27 mg/d，但是統計結果顯示該差異并不顯著(P＞0.05)。本研究還通過排除基因影響因素，驗證了鹽酸胺碘酮與華法林共同使用時對華法林維持劑量有明顯影響，即同時服用胺碘酮的患者所需的華法林維持劑量更低。

本研究驗證了CYP2C9和VKORC1對華法林初始抗凝療效和維持劑量均有明顯的影響。眾多研究均認為，如果針對服用華法林藥物的患者，根據其個人的個性化信息包括年齡、體重、合并用藥等，同時在服用華法林前進行 CYP2C9(rs1057910)、VKORC1等相關基因的SNPs檢測，可使患者能夠更為安全有效的進行抗凝治療。國外許多研究學者和部分國內學者已經通過逐步多重線性回歸的方式對患者所需的華法林維持劑量進行公式化，大部分維持劑量公式約可以解釋40%～60%的個體間劑量差異［14］。部分學者還通過前瞻性研究的方式通過基于華法林藥物基因學的給藥方式對初始用藥患者的抗凝療效進行研究，得到了較好的結果［3，15～16］。因此我們將以本研究的結果作為基礎，建立華法林藥物基因學相關的劑量方程，并進一步在更大樣本的人群中進行驗證。

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