miR-124在乳腺癌中的表達及其作用機制研究

任暉 歐劍鋒 趙慶麗

·臨床研究與應用·

miR-124在乳腺癌中的表達及其作用機制研究

任暉 歐劍鋒 趙慶麗

目的：探討miR-124表達與乳腺癌發生、發展的相關性及機制。方法：運用實時定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測乳腺癌細胞系以及52例患者乳腺癌癌組織和對應的癌旁正常組織樣本中miR-124的表達水平。在乳腺癌細胞株MDA-MB-231和T-47D中過表達miR-124后，測定細胞增殖活性以及侵襲轉移能力。構建熒光素酶報告載體pMIR-特異性蛋白1（specificity protein 1，SP1）的3'UTR，利用熒光素酶活性檢測鑒定miR-124的預測靶基因SP1。qRT-PCR和Western blot法分別檢測SP1的mRNA和蛋白質的表達水平。結果：miR-124在乳腺癌細胞系和癌組織中表達量下調，差異具有統計學意義（P＜0.01），并與腫瘤的轉移、分期、分級和預后相關。在乳腺癌細胞株MDA-MB-231和T-47D中過表達miR-124后抑制乳腺癌細胞系的增殖、侵襲以及遷移（P＜0.01）。轉染miR-124模擬物顯著抑制熒光素酶的活性（P＜0.05）。轉染miR-124模擬物顯著下調MDA-MB-231和T-47D細胞中SP1的mRNA（P＜0.05）和蛋白質的表達水平。結論：miR-124在乳腺癌癌組織中低表達，miR-124低表達與乳腺癌不良預后有關，且miR-124可通過調控轉錄因子SP1抑制乳腺癌癌細胞的增殖、侵襲和轉移。miR-124表達異常減少可能是乳腺癌發生、發展的重要因素。

乳腺癌 miR-124 SP1 預后 乳腺癌細胞系

乳腺癌是女性最常見的癌癥，同時也是導致女性癌癥死亡的最主要病因。最新癌癥統計數據顯示，在世界范圍內乳腺癌的新增病例為1 676 600例，而預計的死亡病例為521 900例［1］。在中國，盡管現代醫療技術在乳腺癌診斷和治療中不斷發展與提高，但在過去的5年中確診為乳腺癌患者的5年總生存率并無實質性提高［2］。因此，深入理解乳腺癌發生發展的作用機制，對乳腺癌的診斷治療有著重要的臨床意義與價值。microRNAs（miRs）是近年來新發現的一類長度較短的非編碼RNA分子，長度為19～23個核苷酸，與靶mRNAs或靶mRNAs的3′非翻譯區互補結合，誘導靶mRNAs降解或抑制靶mRNAs的翻譯，從而實現轉錄后基因的表達調控作用［3］。新近研究發現miR-124在乳腺癌中表達顯著下調，提示其作為一種抑癌基因可能參與了乳腺癌的發生發展，而具體的分子生物學機制尚未闡明［4］。

本研究檢測miR-124在乳腺癌患者的癌組織與對應的癌旁正常組織表達情況，測定過表達miR-124能否抑制乳腺癌細胞的增殖、侵襲與轉移。明確miR-124在乳腺癌中與特異性蛋白1（specificity protein 1，SP1）表達的調控關系及其在乳腺癌發生發展中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織樣本收集2007年5月至2012年4月蘭州軍區總醫院收治的52例乳腺癌患者的組織標本，中位年齡51（37～72）歲，均接受手術治療。組織樣本均經病理學檢查確診，術前未行放化療或其他治療。切除標本后，立即將組織儲存于液氮中，存于-80℃待用。本研究獲得醫院倫理委員會批準。

1.1.2 細胞株乳腺癌MCF-7、T-47D、MDA-MB-468、MDA-231-HM、MDA-MB-231細胞以及人永生化正常乳腺上皮細胞MCF-10A均購自中國上海細胞研究所，轉染用HEK293細胞為本科室自存。

1.1.3 試劑RNA提取試劑Trizol購自美國Life公司。反轉錄試劑盒及定量實時聚合酶鏈反應（qRTPCR）試劑盒均購自大連TaKaRa公司。miR-124逆轉錄引物購于廣州銳博公司。細胞增殖測定試劑盒CCK8購自于上海七海生物技術公司。Invasion和Migration試劑盒均購自美國Millipore公司。野生型SP1的3'UTR以及突變型SP1的3'UTR寡核苷酸在上海英駿公司合成。SP1、GAPDH一抗購于美國Abcam公司，辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG購于北京中杉金橋公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養人乳腺癌細胞及HEK293分別用含10%胎牛血清的DMEM/H培養基在37℃，5%CO2條件下培養。

1.2.2 總RNA提取乳腺癌組織或癌旁正常組織從液氮取出后置于DEPC處理的預冷勻漿器中，以100 mg/mL比例加入Trizol試劑勻漿，按照Trizol試劑操作說明提取組織總RNA并溶于20 μL DEPC水中，分裝凍存于-80℃備用。

1.2.3 qRT-PCR按照TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit說明書加入逆轉錄反應所需試劑、miR-124逆轉錄引物、總RNA進行逆轉錄反應。反轉錄條件：42℃15 min，85℃15 s。合成的cDNA作為模版進行qRT-PCR擴增，根據Premix ExTaq試劑盒說明加入預混合液、miR-124正向引物和miR-124反向引物進行反應。qRT-PCR條件：95℃1 min；95℃15 s、60℃20 s，共行39次循環；采集熒光。20 μL反應體系中取U6作為內參照。qRT-PCR結果采用2-ΔΔCt方法對目的基因在癌組織及癌旁正常組織中的表達量行相對定量分析，ΔΔCt=miR-124的Ct值-U6的Ct值。

1.2.4 細胞增殖、侵襲以及轉移能力的測定MDAMB-231、T-47D細胞分別轉染miR-陰性對照（miR-negative control，miR-NC）、miR-124模擬物（細胞內模擬miR-124發揮相應的功能）。轉染后的細胞采用CCK8試劑盒于24、48、72、96 h，在450 nm波長處測定吸光度值。使用Invasion和Migration試劑盒測定轉染后穿透膜的細胞數目。

1.2.5 pMIR-SP1的3'UTR熒光報告載體構建及熒光素酶活性檢測合成野生型SP1的3'UTR以及突變型SP1的3'UTR寡核苷酸經退火，雙酶切后插入熒光素酶報告基因載體pMIR-REPORT，在含有miR-124結合位點的SP1的3'UTR片段，構建pMIR-SP1的3'UTR載體。HEK293細胞接種于96孔板，24 h后細胞貼壁達70%時進行轉染。轉染分為4組：miR-NC和pMIR-SP1的3'UTR組，miR-124模擬物和pMIRSP1的3'UTR轉染組，miR-NC和突變型pMIR-SP1的3'UTR組，miR-124和突變型pMIR-SP1的3'UTR組。再與質粒pRL-TK共轉染HEK293細胞。轉染24 h后，使用雙熒光素酶報告基因檢測系統處理裂解細胞，檢測熒光強度。

1.2.6 Western blot法將轉染后的MDA-MB-231、T-47D細胞使用細胞裂解緩沖液裂解，12 000 r/min離心10 min，收集上清并行蛋白濃度測定。取25 μg蛋白經10%SDS-PAGE膠分離后，濕轉印至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉，分別采用SP1的一抗（1:1 000稀釋），GAPDH的一抗（1:2 000稀釋）孵育過夜，再與辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG孵育45 min，采用Supersignal West Dura Extended Duration Substrate試劑處理并曝光顯色。

1.3 統計學處理

采用SPSS 18.0軟件進行數據處理。采用配對t檢驗分析組織中miR-124表達差異。Kaplan-Meier和Log rank方法分析miR-124表達與患者生存率關系。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-124在乳腺癌細胞系及組織中的表達水平以及與臨床病理和預后的關系

乳腺癌細胞系檢測結果顯示，miR-124在乳腺癌細胞系MCF-7、T-47D、MDA-MB-468、MDA-231-HM和MDA-MB-231中表達顯著低于人永生化正常乳腺上皮細胞系MCF-10A（圖1A）。乳腺癌組織檢測結果顯示，52例患者的癌組織中miR-124表達顯著低于癌旁正常組織的表達（圖1B）。結合臨床資料數據，結果顯示有淋巴結轉移患者癌組織中miR-124表達顯著低于無淋巴結轉移患者癌組織中的表達（圖1C）。根據TNM分級，Ⅲ～Ⅳ期患者癌組織中miR-124的表達顯著低于Ⅰ～Ⅱ期患者（圖1D）。Kaplan-Meier生存分析顯示，miR-124高表達患者預后明顯好于miR-124低表達者（P=0.03，圖1E）。表明miR-124可能具有抑制乳腺癌發生發展的作用（表1）。

?A.Expression of miR-124 in normal breast epithelial cells and breast cancer cell lines；B.Expression of miR-124 in breast cancer and normal tissues；C.Mean of miR-124 relative levels in breast cancer tissues with or without lymph node metastasis；D.Correlation of miR-124 expression with clinicopathologic stage of breast cancer tissues；E.Kaplan-Meier survival analysis of overall survival duration for two groups defined by low and high expression of miR-124.*P＜0.001圖1miR-124在乳腺癌組織和細胞系中表達Figure 1Expression of miR-124 in breast cancer tissues and cell lines

表1 miR-124表達與52例乳腺癌患者臨床病理特征的關系Table 1Correlation between the clinicopathologic characteristics and miR-124 expression in 52 patients with breast cancer

表1 miR-124表達與52例乳腺癌患者臨床病理特征的關系（續表1）Table 1Correlation between the clinicopathologic characteristics and miR-124 expression in 52 patients with breast cancer（continued）

2.2 miR-124過表達抑制乳腺癌細胞系的增殖、侵襲及轉移

miR-124過表達對乳腺癌細胞系的增殖、侵襲及轉移的結果顯示，轉染miR-124模擬物顯著提高其在MDA-MB-231和T-47D中的表達水平（圖2A、B）。細胞增殖CCK8實驗結果顯示轉染miR-124模擬物與轉染miR-NC相比，miR-124模擬物能夠顯著抑制乳腺癌細胞的增殖（圖2C、D）。侵襲實驗表明，轉染miR-124模擬物與轉染miR-NC相比，miR-124模擬物能夠顯著抑制乳腺癌細胞的侵襲（圖2E）。轉移實驗結果顯示轉染miR-124模擬物與轉染miR-NC相比，miR-124模擬物能夠顯著抑制乳腺癌細胞的遷移能力（圖2F）。

2.3 miR-124靶基因SP1的鑒定以及過表達后對SP1表達的抑制

采用生物信息學軟件（Targetscan）預測miR-124對應的靶基因SP1，同時構建其3'UTR以及突變型3'UTR的熒光素酶報告基因載體（圖3A）。熒光素酶活性檢測結果顯示，轉染miR-124模擬物和pMIRSP1的3'UTR的熒光強度較轉染miR-NC和pMIRSP1的3'UTR顯著降低（P＜0.05），miR-124對pMIRSP1的3'UTR的表達具有抑制作用，并且該抑制功能通過miR-124與pMIR-SP1的3'UTR區結合實現，提示SP1是miR-124的靶基因（圖3B）。為分析乳腺癌細胞中miR-124對SP1 mRNA和蛋白質水平的抑制作用，轉染miR-NC、miR-124模擬物后SP1 mRNA和蛋白水平變化的檢測結果顯示，轉染miR-124模擬物后SP1 mRNA水平較轉染miR-NC顯著降低（圖3C，P＜0.01），轉染miR-124模擬物后SP1蛋白質表達水平亦較轉染miR-NC顯著降低（圖3D）。以上結果表明，乳腺癌細胞中miR-124可抑制SP1表達，乳腺癌中miR-124的低表達提高了SP1的表達，促進腫瘤的發生和發展。因此，miR-124低表達可能是乳腺癌發生發展中的一個重要因素。

圖3 miR-124與SP1的靶向關系Figure 3Relationship between the miR-124 level and SP1 target gene

3 討論

本研究檢測乳腺癌細胞系以及52例乳腺癌患者的癌組織和癌旁正常組織中miR-124的表達水平，結果顯示miR-124在乳腺癌細胞系中的表達水平顯著低于人永生化正常乳腺上皮細胞系MCF-10A中的表達水平，同時其在乳腺癌組織的表達水平顯著低于對應的癌旁正常組織的表達水平，這與其他文獻的報道是一致的［4］。體外實驗中，本研究發現miR-124的過表達能夠顯著抑制乳腺癌細胞系的增殖、侵襲以及遷移能力，通過熒光素酶活性檢測鑒定了miR-124可直接靶向調節SP1的3'UTR，同時轉染miR-124模擬物能顯著抑制MDA-MB-231、T-47D細胞中SP1的mRNA以及蛋白的表達水平。

miRs在細胞分化、增殖、代謝等過程中發揮重要的調節作用［5-6］。研究表明，miRs作為一類新的癌基因或抑癌基因，其表達失衡與多種癌癥的發生密切相關［7］，如結腸癌、胃癌、肺癌等［8］。近年來，miRs與乳腺癌的關系越來越受關注，已證實miR-7、miR-100、miR-141、miR-429、miR-503等［9］參與乳腺癌的發生、發展和預后。miR-124與多種腫瘤發生、進展相關，包括肺癌［10］、結直腸癌［11］、腎癌［12］、前列腺癌［13］等多種腫瘤。在結直腸癌中miR-124能夠通過調控PTB1/PKM1/PKM2反饋的級聯通路而抑制結直腸癌的生長［11］，但miR-124在乳腺癌的發生發展及其作用機制尚不清楚。本研究證實miR-124在乳腺癌組織中的表達水平顯著低于其對應的癌旁組織中的表達水平，更重要的是過表達miR-124能夠顯著抑制乳腺癌細胞的增殖、侵襲以及遷移。提示miR-124低表達能夠促進乳腺癌的發生發展，提高miR-124的表達水平可能抑制乳腺癌細胞的增殖，侵襲和遷移。

SP1是SP轉錄因子家族的重要成員，SP家族的蛋白質結構特點是含有C2H2類型的鋅指結構，能夠調控大量的看家基因［14］?？醇一蛟谀[瘤的發生和發展過程中發揮著重要的作用，同時該研究證實SP1在多種腫瘤中表達顯著上調，且高表達與不良預后相關。在乳腺癌中已證實SP1在癌組織中高表達［15］。這些研究表明轉錄因子SP1及其調控的下游信號通路在乳腺癌的發生發展中有著重要的意義。本研究利用熒光素酶活性檢測鑒定SP1為miR-124的靶基因，明確miR-124與SP1的調控關系，為闡明乳腺癌的發生機制提供了新的線索。

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（2015-08-24收稿）

（2015-09-29修回）

Role of miR-124 in breast cancer and its underlying mechanism

Hui REN，Jianfeng OU，Qingli ZHAO

Department of Breast Surgery，Lanzhou Military Region General Hospital，Lanzhou 730000，China

Hui REN；E-mail:renhuilanzhou@126.com

Objective:To evaluate the role of miR-124 in breast cancer and its underlying mechanism.Methods:Quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction（qRT-PCR）was employed to quantify the expression level of miR-124 in the breast cancer cell lines and matched tissues of 52 patients.Cell proliferation，invasion，and migration of MDA-MB-231 and T-47D were determined by miR-124 overexpression in vitro.Luciferase vectors（pMIR-SP1 3'UTR）were also constructed.The predicted target gene of miR-124 was identified via luciferase activation assay.The mRNA and protein expression of SP1 was detected via qRT-PCR and Western blot，respectively.Results:MiR-124 was decreased in breast cancer tissues and cell lines.This result is correlated with metastatic capacity，TMN stages，and prognosis in breast cancer tissues.In breast cancer cell lines，ectopic overexpression of miR-124 inhibited cell proliferation，invasion，and migration in vitro.MiR-124 mimics significantly inhibited luciferase activation（P＜0.05）in HEK293 cells and could significantly decrease the mRNA（P＜0.05）and protein expression levels of SP1 in MDA-MB-231 and T-47D cells.Conclusion:MiR-124 could be inhibited in breast cancer.The low miR-124 expression is associated with poor prognosis.In addition，miR-124 could inhibit cell proliferation，invasion，and migration by targeting SP1.These findings confirm that miR-124 downregulation may be a key mechanism for breast cancer carcinogenesis.

breast cancer，miR-124，SP1，prognosis，breast cancer cell line

10.3969/j.issn.1000-8179.2015.20.925

蘭州軍區蘭州總醫院乳腺外科（蘭州市730000）

任暉renhuilanzhou@126.com

任暉專業方向為乳腺外科及乳腺癌靶向治療。

E-mail：rh999888@126.com