BMP4通過誘導EMT促進肝癌遷移侵襲*

李霄孫保存邵兵趙秀蘭張艷輝古強劉鐵菊

·基礎研究·

BMP4通過誘導EMT促進肝癌遷移侵襲*

李霄①②孫保存①②③邵兵①趙秀蘭①②張艷輝③古強①②劉鐵菊①②

目的：檢測BMP4在肝癌中的表達并探討BMP4在誘導肝癌EMT中的作用，進而研究其對肝癌細胞遷移侵襲能力的影響。方法：采用免疫組織化學方法檢測肝癌組織中BMP4的表達，分析其與肝癌臨床病理資料之間的關系。將BMP4表達質粒轉染至肝癌細胞系HepG2中，誘導BMP4外源性過表達。觀察BMP4轉染前、后HepG2的細胞形態學改變；Western blot檢測轉染前、后HepG2中BMP4、EMT相關蛋白（E-cadherin、Vimentin）表達變化情況；劃痕和侵襲實驗檢測BMP4對細胞遷移侵襲能力的影響。結果：BMP4與患者的年齡、病理分級、臨床分期、不良預后密切相關。BMP4過表達后HepG2呈現典型的EMT形態學改變，E-cadherin表達下調、Vimentin表達上調、細胞的遷移侵襲能力顯著增強。結論：BMP4與肝癌臨床病理資料密切相關，并可能通過誘導EMT促進肝癌細胞的遷移侵襲能力。

肝細胞癌 BMP4 上皮間質轉化 遷移 侵襲

1Department of Pathology,Tianjin Medical University,Tianjin 300070;2Department of Pathology,Tianjin Medical University General Hospital,Tianjin 300052;3Department of Pathology,Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital,Tianjin 300060,China

This work was supported by the Key Project of the National Natural Science Foundation of China(No.81230050),the National

Natural Science Foundation of China(No.81172046 and 81173091),and the Key Project of the Tianjin Natural Science Foundation(No.12JCZDJC23600)

原發性肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是我國高發、危害極大的惡性腫瘤，其發病隱匿，侵襲性生長快速，并且手術切除率很低，術后5年內復發率高達50%～70%。造成這種結局的主要原因是

HCC的高侵襲性和肝內和（或）肝外轉移［1-4］。因此，研究HCC遷移侵襲的發生機制對改善肝癌患者預后，延長患者生存期具有重要的意義。研究發現，上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）在HCC的遷移侵襲過程中起到關鍵性的作用［5］。因此，研究肝癌EMT的發生將有助于揭示肝癌遷移侵襲的調控機制，并可能為尋找肝癌治療靶點提供理論基礎。BMP4作為TGF-β超家族中的一員［6］，在腫瘤的演變過程中發揮著重要作用［7-11］。但BMP4是否通過誘導EMT促進肝癌遷移侵襲的探討尚少。因此本研究首先采用免疫組織化學法檢測肝癌組織中BMP4的表達情況，并探討BMP4與肝癌臨床病理資料的相關性。其次將BMP4表達質粒轉染入HepG2細胞中，觀察BMP4過表達的HepG2細胞的形態學變化以及E-cadherin、Vimentin表達的變化，并觀察BMP4對HepG2細胞遷移侵襲能力的影響，探討BMP4是否能通過誘導EMT的發生從而促肝癌的遷移侵襲能力。本研究旨在為肝癌的診斷、治療提供新的思路和有效途徑。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1組織標本選取天津醫科大學腫瘤醫院和天津醫科大學總醫院2001年2月至2005年11月經手術切除并病理診斷為原發性肝細胞肝癌并且隨訪資料完整的患者標本92例。

1.1.2細胞株人肝癌細胞株HepG2為天津醫科大學病理學實驗室自存。

1.1.3實驗試劑DMEM購自美國Neuronbc公司，胎牛血清購自中國Thermo公司。載體為pEZ-M98的BMP4表達質粒購自GeneCopoeia，Inc.（catalog no. EX-A0242-M98）。細胞轉染試劑聚乙酰亞胺（percutaneous ethanol injection，PEI）購自美國Polyscience公司。Transwell小室購自美國FALCON公司。兔抗人單克隆抗體BMP4、鼠抗人單克隆抗體E-cadherin、兔抗人多克隆抗體Vimentin均購自美國Abcam公司。兔抗人多克隆抗體GAPDH、PV6000通用二步法免疫組化試劑盒、山羊抗兔IgG抗體、山羊抗鼠IgG抗體均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2方法

1.2.1免疫組織化學染色HCC組織石蠟包塊4 μm連續切片常規脫蠟水化；3%過氧化氫滅活內源性過氧化物酶；微波熱修復；正常血清室溫封閉，一抗4℃過夜，次日二抗孵育，DAB顯色，蘇木素復染細胞核，封片。PBS代替一抗作為陰性對照。染色結果判斷標準：陽性細胞百分率為每例標本選擇10個代表性的高倍（×400）視野分別計數100個腫瘤細胞，取平均值為陽性細胞百分率。規定0%為0分，1%～10%為1分，11%～50%為2分，＞50%為3分。染色強度：陰性為0分，淺黃色為1分，深黃色為2分，棕黃色為3分。染色指數為陽性細胞百分率與染色強度的乘積。染色指數≥4分為BMP4免疫組織化學染色陽性（+），＜4分為陰性（-）。

1.2.2細胞系和培養條件人肝癌細胞系HepG2按常規培養模式進行培養：培養基為Dulbecco's modified Eagle's medium（DMEM），添加10%胎牛血清（FBS）。培養條件為37℃，5%CO2恒濕環境。

1.2.3細胞轉染細胞培養至70%～80%匯合時轉染，轉染前更換為無血清、無抗生素的新鮮培養液。以1:2比例混勻質粒和轉染試劑（PEI），靜置10 min后加入培養基中，6 h后更換為條件培養液。轉染48 h后進行轉染效果評價。

1.2.4細胞形態檢測在細胞培養狀態下，將穩轉BMP4后的HepG2細胞置于倒置顯微鏡下觀察轉染前后EMT形態的改變。

1.2.5Western blot法檢測用細胞裂解液RIPA-SDS裂解細胞，提取其總蛋白，在10%聚丙烯酰胺凝膠中電泳。PVDF膜轉膜1.5 h，5%脫脂奶粉封閉室溫1 h，加入一抗，4℃孵育過夜，次日恢復室溫后與相應二抗2 h，TBST漂洗，加入發光液顯影、定影、照相。

1.2.6細胞劃痕實驗將細胞接種于6孔板，用100 μL Tip頭對其表面進行劃痕，PBS洗掉游離細胞后，加入培養基，此時記為0 h，隨機取5個視野，在倒置顯微鏡下觀察細胞從劃痕向中央遷移的情況，分別于0、24、48、72 h拍照測量劃痕距離，并計算遷移率。

1.2.7細胞侵襲實驗將Transwell小室包被Matirge膠并在培養箱中過夜，次日消化細胞并用無血清的DMEM培養液重懸，將細胞懸液接種于上室，下室用常規培養基，培養48 h后取出Transwell小室，甲醇固定，結晶紫染色，分析穿透能力。

1.3統計學分析

采用SPSS 17.0統計軟件包進行分析，計量資料采用t檢驗。計數資料采用χ2檢驗。采用Kaplan-Meier方法進行生存分析，生存率比較采用Log-rank檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1BMP4的表達及與HCC患者臨床病理資料的關系

免疫組織化學染色結果顯示，BMP4陽性表達產物呈棕黃色，主要定位于肝癌細胞漿（圖1）。在92例肝癌標本中，BMP4陽性表達56.52%（52/92）。分析BMP4的表達與HCC患者臨床病理資料的關系顯示，BMP4在年齡＞45歲的患者中表達較高，而在≤45歲

的患者中表達較低，差異有統計學意義（χ2=8.400，P= 0.004）。BMP4在不同病理分級的患者中表達不同，BMP4在低分化（Ⅲ～Ⅳ級）的患者中表達高于高分化（Ⅰ～Ⅱ級）的患者，差異具有統計學意義（χ2= 4.048，P=0.044）。BMP4在不同臨床分期的患者中表達也不同，在Ⅲ～Ⅳ期患者中的表達較Ⅰ～Ⅱ期的患者表達高，差異有統計學意義（χ2=5.475，P=0.019）。BMP4在不同性別、腫瘤大小、有無轉移患者中的差異無統計學意義（P＞0.05，表1）。生存分析結果顯示，BMP4陽性組較BMP4陰性組的生存時間短，差異有統計學意義（P=0.04，圖2）。

圖1 BMP4在肝癌組織中定位于細胞漿的陽性表達及BMP4在肝癌組織中的陰性表達（IHC×400）Figure 1Representative BMP4-positive HCC samples with staining mainly in the cytoplasm and BMP4-negative HCC samples showing almost no appreciable staining（IHC×400）

表1 BMP4與肝癌臨床病理資料的關系Table 1Correlation between BMP4 and clinicopathologic data of HCC patients

圖2 BMP4（+）患者較BMP4（-）患者的生存時間短Figure 2Kaplan-Meier survival analysis showed that BMP4-positive patients had shorter survival periods than BMP4-negative patients

2.2HepG2細胞轉染BMP4后細胞形態的變化

HepG2細胞轉染BMP4表達質粒，構建HepG2-BMP4上調模型后，在倒置顯微鏡下觀察發現，HepG2-BMP4細胞與未轉染細胞（HepG2）相比，其形態發生了明顯改變，細胞由排列緊密如鋪路石樣的結構轉變為成纖維細胞樣，呈現典型的EMT形態學改變（圖3）。

2.3HepG2細胞轉染BMP4后BMP4、E-cadherin、Vimentin的表達變化

利用Western blot檢測轉染前、后HepG2細胞BMP4、E-cadherin、Vimentin的表達變化情況，結果顯示，轉染BMP4后，HepG2細胞BMP4表達明顯增高，提示轉染成功。過表達BMP4后可以使HepG2細胞E-cadherin的表達下調，Vimentin的表達上調（圖4）。結果說明BMP4能夠通過調控上皮表型（E-cadherin）和間質表型（Vimentin）的表達參與EMT。

2.4HepG2細胞轉染BMP4后細胞遷移能力的變化

采用細胞劃痕實驗評價轉染BMP4后HepG2細胞遷移、運動能力的變化情況。實驗結果表明，HepG2細胞過表達BMP4后，與未轉染組相比，在24、48、72 h時間點，其細胞遷移能力顯著增強，差異具有統計學意義（P＜0.05，圖5）。結果表明，BMP4可以促進HepG2細胞的遷移和運動。

2.5HepG2細胞轉染BMP4后細胞侵襲能力的變化

采用細胞侵襲實驗評價轉染BMP4后HepG2細胞侵襲能力的變化情況。結果表明，轉染BMP4后，細胞穿透濾膜至小室背面的細胞數顯著高于未轉染預組，差異具有統計學意義（P＜0.05，圖6）。結果表明，BMP4可以促使細胞侵襲能力明顯增強。

圖3 BMP4轉染后HepG2細胞結構改變（×100）Figure 3After BMP4 transfection，the morphology of HepG2 cells showed significant changes from a paving stone structure with cell-cell adhesion（right）to a fibroblastic shape（left），which showed typical EMT change（×100）

圖4 Western blot檢測BMP4轉染前、后HepG2細胞中BMP4、EMT相關蛋白（E-cadherin、Vimentin）的表達變化Figure 4Changes of BMP4 and EMT-related protein（E-cadherin and Vimentin）expression in HepG2 cells were detected by Western blot after BMP4 transfection

?A.Wound healing assay（×40）；B.Statistics of analysis of migration rate datainHepG2-BMP4 cells and HepG2 cells at 24，48，and 72 h（P＜0.05）圖5過表達BMP4對HepG2細胞遷移能力的影響Figure 5Effects of BMP4 on the migration capacity of HepG2 cells

圖6 過表達BMP4對HepG2細胞侵襲能力的影響Figure 6Effects of BMP4 on the invasion capacity of HepG2 cells

3 討論

肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，根治性切除機會極少，術后復發率極高，遷移和侵襲是肝癌復發的主要因素。腫瘤遷移侵襲涉及多種調控機制，其中重要機制之一就是上皮間質轉化（EMT）。EMT是指上皮細胞在特定的情況下向間質細胞轉化的現象，其主要特征為上皮表型的喪失及間質表型（vimentin）的獲得。越來越多的證據表明EMT在肝癌細胞的播散過程中發揮著極其重要的作用［12-15］。EMT的發生受許多細胞因子及微環境的調控，其中TGF-β是調控生長和分化的相關多肽因子家族之一。TGF-β家族成員可以在許多病理情況下啟動和維持EMT，尤其是通過重要信號通路的激活［16］。TGF-β通路是目前公認的作用比較明確的誘導EMT的信號通路［17］。

BMP4作為TGF-β超家族的一員，其生物學功能相當廣泛，包括促進骨和軟骨的生成，調控多種細胞的增殖和分化，并在多種臟器的生長發育中發揮重要作用［18］。BMP4主要通過經典通路發揮其作用，即BMP4在與相應的細胞受體結合后，其生物信號主要通過TGF-β/Smads分子通路進行傳導，進而調控相關轉錄因子最終對機體進行功能調節［19］。近年來有研究發現BMP4可誘導某些上皮細胞源性腫瘤細胞發生EMT從而促進其遷移侵襲，如在乳腺癌和胰腺癌中，BMP4可以通過經典通路誘導EMT的發生進而促進腫瘤細胞的遷移侵襲能力［20-21］。但BMP4在肝癌中是否可以通過誘導EMT從而促進遷移侵襲尚不清

楚。本實驗主要研究BMP4在誘導肝癌EMT發生中的作用，進一步明確其在肝癌遷移侵襲中的重要作用。在前期研究中用免疫組織化學方法檢測肝癌組織中BMP4的表達發現，BMP4在肝癌患者中呈較高表達，并與患者的年齡、病理分級、臨床分期、不良預后密切相關，提示BMP4可能與肝癌的高遷移侵襲能力有關。在此基礎上，本研究將BMP4轉染入肝癌細胞HepG2中，誘導外源性BMP4過表達。經形態學檢測，過表達BMP4后的HepG2細胞的形態發生了明顯變化，呈典型的EMT形態學改變，并且與未轉染BMP4的HepG2細胞相比，HepG2-BMP4細胞中上皮標志物E-cadherin表達明顯降低，間質標記物Vimentin表達明顯升高，這說明BMP4可以誘導HepG2細胞EMT的發生，同時HepG2細胞在體外的遷移侵襲能力也顯著增強，說明在體外BMP4能夠促進肝癌細胞的遷移侵襲，這與本實驗的前期研究結果相吻合。

綜合以上研究結果，本研究認為BMP4可以通過誘導肝癌細胞發生EMT促進肝癌的遷移侵襲，這可能為肝癌的診斷、治療提供新的思路和有效途徑。但是BMP4在肝癌中促進腫瘤遷移侵襲的內在機制很復雜，誘導EMT可能只是其中的某一個環節，因此BMP4在肝癌細胞遷移侵襲過程中的其他作用機制，還需要進一步探討。

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（2014-09-10收稿）

（2014-10-25修回）

（編輯：周曉穎）

BMP4 promotes migration and invasion of hepatocellular carcinoma by inducing epithelial-mesenchymal transition

Xiao LI1,2,Baocun SUN1,2,3,Bing SHAO1,Xiulan ZHAO1,2,Yanhui ZHANG3,Qiang GU1,2,Tieju LIU1,2

Baocun SUN;E-mail:Sunbaocun@aliyun.com

Objective:To determine the expression of BMP4 in hepatocellular carcinoma(HCC)and to study the role of BMP4 in inducing epithelial-mesenchymal transition(EMT)to analyze the effect of BMP4 on the migration and invasion of HCC cells. Methods:The expression of BMP4 in HCC specimens was examined by immunohistochemistry staining,and the correlations were analyzed between the expression of BMP4 and clinicopathological data.The BMP4 expression plasmid was transfected into HepG2 cells to induce exogenous overexpression of BMP4 protein.The changes of HepG2 cell morphology were detected after BMP4 transfection by using a microscope;the changes of the expression of BMP4,EMT-related protein(E-cadherin,Vimentin)in HepG2 cells were detected by Western blot after transfection of BMP4;the wound healing assay in vitro was used to detect the effects of BMP4 gene transfection on the ability of migration of HepG2 cells;the invasion assay was used to determine the role of transfection of BMP4 on the invasive potential of HepG2 cells.Results:Immunohistochemistry staining method displayed that BMP4 expression was positively associated with age,histological differentiation,stage,and poor prognosis.After BMP4 overexpression,the morphology of HepG2 cells showed significant changes from a paving stone structure with cell-cell adhesion to a fibroblastic shape,which showed typical EMT change;Western blot exhibited that the expression of E-cadherin was downregulated and the Vimentin expression was upregulated in HepG2 cells;the wound healing and invasion assay showed that the migration and invasion potentials of HepG2 cells were significantly enhanced.Conclusion:BMP4,which displayed a high expression in HCC specimens,was closely associated with clinicopathologic data,and BMP4 may promote migration and invasion of HCC cells by inducing epithelial-mesenchymal transition.

hepatocellular carcinoma(HCC),BMP4,epithelial-mesenchymal transition(EMT),migration,invasion

10.3969/j.issn.1000-8179.20142038

①天津醫科大學病理教研室（天津市300070）；②天津醫科大學總醫院病理科；③天津醫科大學腫瘤醫院病理科

*本文課題受國家自然科學基金重點項目（編號：81230050）、國家自然科學基金面上項目（編號：81172046，81173091）和天津市自然科學基金

重點項目（編號：12JCZDJC23600）資助

孫保存Sunbaocun@aliyun.com

李霄專業方向為腫瘤病理學。

E-mail：1318168534@qq.com