CYP2C19顯色型基因芯片的研究

邢軍芬，汪濤，張瑩，朱濱

·論著·

CYP2C19顯色型基因芯片的研究

邢軍芬，汪濤，張瑩，朱濱

目的提供一種基于顯色原理的CYP2C19基因芯片診斷方法。

方法采用堿性磷酸酶促顯色原理設(shè)計制備固定有*2、*3檢測探針的CYP2C19基因芯片，通過EDTA抗凝外周血樣本提取基因組DNA，PCR擴增CYP2C19*2、*3突變片段并與芯片在43℃雜交，經(jīng)洗滌、顯色后掃描獲取圖像，經(jīng)軟件分析輸出基因型并對基因芯片性能進行系統(tǒng)評價。

結(jié)果CYP2C19顯色型基因芯片檢出限為20 ng基因組DNA；與基因組DNA同等濃度魚精DNA檢測信號陰性；用*2/*2、*1/*3基因型樣本重復(fù)檢測10次，結(jié)果一致；常見濃度的甘油三酯、總膽固醇、膽紅素和完全溶血對測定沒有影響。臨床三家醫(yī)院臨檢實驗室對1000例臨床樣本的檢測與雙向測序方法比對驗證，結(jié)果一致。

結(jié)論為高通量基因診斷產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)化提供了一種實用的技術(shù)選擇。

芯片分析技術(shù)；多態(tài)性，單核苷酸；基因分型技術(shù)；CYP2C19

基因芯片技術(shù)（即基因微陣列），是近年來發(fā)展起來的一種快速、高效核酸分析手段，美國FDA、中國CFDA均已批準基于基因芯片技術(shù)的基因診斷試劑上市，并廣泛用于病源耐藥基因篩查，疾病相關(guān)基因診斷和個體化用藥基因診斷等［1-3］。但目前的基因芯片產(chǎn)品主要采用熒光檢測原理，存在主要熒光標記原料被少數(shù)公司專利壟斷，采用激光光源的熒光檢測設(shè)備價格不菲，熒光信號易受光照等因素干擾導(dǎo)致重現(xiàn)性不佳，CV值偏大，檢測后的芯片不能長期保存等不足，阻礙了該技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化。

本研究旨在研究一種能克服上述不足的，基于顯色原理的基因芯片技術(shù)，并用于CYP2C19基因多態(tài)性檢測。眾多研究顯示，CYP2C19基因具有遺傳多樣性，其中CYP2C19*2和CYP2C19*3型是人體內(nèi)發(fā)生頻率最高的主要突變形式［4-5］，前者導(dǎo)致剪切異常［6］，后者產(chǎn)生了提前終止密碼子［7］。CYP2C19*2和CYP2C19*3等位基因編碼的酶無活性，是導(dǎo)致人體對經(jīng)由CYP2C19代謝藥物出現(xiàn)代謝能力個體差異的主要原因。檢測CYP2C19基因型對臨床開展個體化用藥具有重要現(xiàn)實意義。建立并評價CYP2C19顯色型基因芯片檢測技術(shù)不論對產(chǎn)業(yè)發(fā)展還是臨床應(yīng)用都有積極的現(xiàn)實意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

DNA提取試劑盒（BST01051）、雜交顯色試劑盒（BST03021）、醛基修飾基片（BSM03011）等購自上海百傲科技股份有限公司。Taq酶和10× buffer購自天根生化科技（北京）有限公司；dNTP為上海生工生物工程服務(wù)有限公司產(chǎn)品；EDTA抗凝外周靜脈血樣本為上海市第一人民醫(yī)院贈送；膽紅素（純度＞98%）購自上海源葉生物有限公司；膽固醇（99%）和甘油三酯購自上海將來實業(yè)有限公司。

Bioer TC-96/G/H（b）PCR儀為杭州博日科技有限公司產(chǎn)品；飛鴿TGL-16GB離心機為上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；onedrop1000紫外分光光度計為上海諾晶生物有限公司產(chǎn)品；GSM417點樣儀為美國Affymetrix公司產(chǎn)品；雜交檢測設(shè)備，如生物芯片全自動雜交儀（BR-526-6）、生物芯片識讀儀（BE-2.0）和基因芯片圖像分析軟件（Arraydoctor2.0）為上海百傲科技股份有限公司產(chǎn)品；PowerBC-600BC凝膠電泳儀為上海博彩生物科技有限公司產(chǎn)品；Bioshine Gelx 1520凝膠成像系統(tǒng)為上海鷗翔生物有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 樣本處理用DNA純化試劑盒從EDTA抗凝外周靜脈血樣本中提取全基因組DNA。DNA濃度為10～60 ng/μl，A260/A280的比值在1.5～2.0。根據(jù)NCBI上CYP2C19*2和CYP2C19*3的上下游序列信息，設(shè)計2對引物和一個質(zhì)控寡核苷酸。CYP2C19*2：5'Biotin-CTTGGCATATTGTATCT ATACCTTT 3'和3'TAAACATCCGTAGTAAACA CAAAAC 5'；CYP2C19*3：5'Biotin-CACCCTGTGA TCCCACTTTC 3'和3'TATTCACCCCATGGCTG TCT 5'；質(zhì)控寡核苷酸：5'Biotin-ACATCCTCTAAA TGATGTGAGACCATGCGGAGCCCCTCCACG 3'。擴增管1取已純化的DNA 5.0 μl作為擴增模板，加入CYP2C19*2上游引物10 pmol/μl、下游引物3.3 pmol/μl各1.0 μl，Taq酶（2.5 U/μl）1.0 μl，10×buffer 2.5 μl，dNTP（各2.5 mmol/L）2.5 μl，雙蒸水12 μl，反應(yīng)總體積25 μl。擴增管2取已純化的DNA 5.0 μl作為擴增模板，加入CYP2C19*3上游引物（10 pmol/μl）、下游引物（3.3 pmol/μl）各1.0 μl，Taq酶（2.5 U/μl）1.0 μl，10×buffer 2.5 μl，dNTP（各2.5 mmol/L）2.5 μl，雙蒸水12 μl，反應(yīng)總體積25 μl。PCR反應(yīng)條件為：50℃5 min；94℃5 min；94℃25 s，48℃40 s，72℃30 s，35個循環(huán)；72℃5 min；PCR產(chǎn)物4℃保存。

1.2.2 CYP2C19基因顯色芯片的制備針對CYP2C19*2和CYP2C19*3的序列信息設(shè)計兩對探針和一個質(zhì)控探針。CYP2C19*2中681A位點：5'NH2-（T）16ATTATTTCCCAGGAACCCAT 3'；681G位點：5'NH2-（T）16ATTATTTCCCGGGAACCC 3'；CYP2C19*3中636G位點：5'NH2-（T）16ACCCC CTGGATCCAGGTA 3'；636A位點：5'NH2-（T）16ACCCCCTGAATCCAGGTAAG 3'；質(zhì)控探針：5' NH2-（T）16AATCTCACATCATCCAGAGGATGT 3'。采用GSM-417生物芯片點樣儀，根據(jù)設(shè)計的陣列的點陣排布，如圖1所示，在醛基修飾基片上進行點樣。點樣時，環(huán)境溫度在18～26℃，相對濕度為45%～65%。探針點樣濃度為5 μmol/L。將點好的芯片置于室溫過夜固定，避光保存。

圖1 CYP2C19芯片陣列點樣分布圖Figure 1Distribution of the probes on chip

1.2.3 雜交檢測BaiO?e-Hyb全自動雜交儀按表1設(shè)置反應(yīng)程序，按表要求用量分裝雜交顯色試劑盒中各試劑。吸取150 μl雜交液，分別加入包含上述兩個檢測位點的擴增產(chǎn)物各10 μl，混勻。并將各試劑放入指定位置內(nèi)，運行程序，雜交顯色反應(yīng)自動進行。雜交完成后，將芯片顯色區(qū)用蒸餾水輕微沖洗、烘干，將芯片放入BE-2.0生物芯片識讀儀中進行掃描，獲得的芯片雜交結(jié)果圖像用基因芯片圖像分析軟件提取各點的信號強度，輸入基因判型的閾值，由軟件進行數(shù)據(jù)分析，輸出芯片檢測的基因型結(jié)果。

1.2.4 CYP2C19顯色型基因芯片性能評價

1.2.4.1 芯片檢測靈敏度：選取經(jīng)測序驗證基因型為*2/*3的樣本，提取基因組DNA，濃度調(diào)整為50 ng/μl，進行梯度稀釋。將每個稀釋度DNA進行PCR擴增并與芯片雜交，以重復(fù)3次檢測判型結(jié)果均正確的最低DNA量為檢出限。

1.2.4.2 芯片檢測準確度：選取6種CYP2C19基因型的濃度為50 ng/μl基因組DNA，分別進行PCR擴增并與芯片雜交。

表1 雜交體系和反應(yīng)程序Table 1Hybridization system and amplification reaction program

1.2.4.3 芯片檢測特異性：取魚精DNA稀釋至接近于正常人基因組DNA抽提濃度（20 ng/μl）作為陰性對照進行PCR擴增并與芯片雜交。

1.2.4.4 芯片檢測重復(fù)性：選取*2/*2，*1/*3基因型的濃度為25 ng/μl基因組DNA，進行PCR擴增并與芯片雜交，每個樣本重復(fù)檢測10次。

1.2.5 CYP2C19顯色型基因芯片干擾實驗取2～8℃保存不超過5 d的3種CYP2C19基因型（CYP2C19*1/*1、CYP2C19*1/*2、CYP2C19*1/*3）的EDTA抗凝外周全血樣本，每種樣本分成5份，1份不加干擾物作為空白對照，1份加入3000 mg/dl甘油三酯，1份加入250 mg/dl膽固醇，1份加入20 mg/dl膽紅素，1份完全溶血。按照血液基因組DNA提取方法提取上述樣本血液基因組DNA，經(jīng)PCR擴增并與芯片雜交檢測基因型，每種樣本重復(fù)2次，樣本量少的基因型只做1次。

1.2.6 CYP2C19顯色型基因芯片精密度實驗選擇3個基因型已知（雙向測序）的樣本，每個樣本分成3份，分別送至3家醫(yī)療機構(gòu)實驗室進行測定。每個實驗室采用3個批號的試劑盒，每個批號試劑對每個樣品由同一實驗室的3名檢驗員各測定3次。根據(jù)正確測定結(jié)果占總測定結(jié)果的百分率計算試劑盒產(chǎn)品的批內(nèi)、批間精密度和差異。

1.2.7 CYP2C19顯色型基因芯片方法比對實驗將基因芯片檢測結(jié)果與雙向測序結(jié)果比較，評價CYP2C19顯色型基因芯片方法臨床適用性。選擇3家醫(yī)療機構(gòu)實驗室，選取來自臨床檢驗的EDTA抗凝血樣，不分病種、檢測目的、性別、年齡，只要滿足雙向測序和芯片檢測對樣本量要求即可。將選取的臨床患者檢測樣本一分為二，一份直接由測序機構(gòu)對樣本基因組DNA中CYP2C19基因的681G＞A，636G＞A位點進行雙向測序；一份進行芯片檢測。測序不成功或芯片未檢出的樣本予以剔除。比對兩者結(jié)果的符合性，求算檢出率和正確率。

1.2.8 CYP2C19顯色型基因芯片存儲穩(wěn)定性實驗取制備好的CYP2C19基因芯片24片及配套的PCR擴增及雜交顯色試劑，置于-20℃冰箱長期儲存，分別于0、1、3、6、12、18個月各取出3片，用新鮮EDTA抗凝血樣提取的濃度稀釋至8 ng/μl的DNA進行PCR擴增并與芯片雜交，結(jié)果與新制備的CYP2C19基因芯片及配套的PCR擴增及雜交顯色試劑檢測結(jié)果比較。

2 結(jié)果

2.1 芯片檢測性能

對CYP2C19顯色型基因芯片的靈敏度、準確度、特異性和重復(fù)性等性能指標進行檢測。結(jié)果顯示，CYP2C19顯色型基因芯片的最低檢出限為5 ng基因組DNA；6種基因型檢測結(jié)果與測序結(jié)果一致；對陰性對照進行檢測，結(jié)果為陰性；每個樣本重復(fù)10次，基因型檢測結(jié)果均一致。

2.2 芯片干擾實驗

研究結(jié)果顯示，含有干擾物質(zhì)的血樣，經(jīng)DNA提取后，DNA的濃度和純度與正常空白血樣相比，沒有顯著差異，經(jīng)PCR擴增及基因芯片雜交檢測，結(jié)果正常并與已知基因型一致。因此EDTA抗凝全血樣本中含有3000 mg/dl的甘油三酯，250 mg/dl的總膽固醇，20 mg/dl的膽紅素對CYP2C19基因芯片測定沒有影響，完全溶血的EDTA抗凝全血對測定也沒有影響。

2.3 芯片精密度實驗

精密度實驗共獲得243個檢測結(jié)果。243個檢測結(jié)果與已知基因型均相符。以定性結(jié)果評價，批內(nèi)批間均無差異，精密度達100%。

2.4 芯片方法比對實驗

3家醫(yī)療機構(gòu)實驗室對1035份新鮮采集的EDTA抗凝全血樣本進行芯片檢測，共獲得1020個檢測結(jié)果，顯示存在6種基因型，芯片檢測結(jié)果如圖2所示。其中有15份樣本未檢出。上述1035份樣本的提取DNA送交測序，獲得1008份測序結(jié)果，有27份樣本測序失敗。將檢測結(jié)果完整的1004份樣本的芯片檢測結(jié)果和基因測序結(jié)果比對，有1001份樣本芯片檢測結(jié)果與測序結(jié)果完全一致，有3份樣本檢測結(jié)果不一致。經(jīng)分析這3個樣本基因組DNA濃度均小于檢出限，不排除DNA提取過程中試劑漏加的可能。方法比對研究結(jié)果見表2。經(jīng)統(tǒng)計分析，測試試劑盒臨床檢測的檢出率為98.55%（1020/1035）；正確率為99.70%（1001/1004）。

2.5 芯片儲存穩(wěn)定性實驗

芯片檢測結(jié)果顯示，-20℃儲存芯片與新制備芯片的靈敏度檢測結(jié)果相同，說明芯片性能沒有明顯變化，具有良好穩(wěn)定性。

圖2 CYP2C19顯色型基因芯片檢測結(jié)果（A：CYP2C19基因*1/*1型；B：CYP2C19基因*2/*2型；C：CYP2C19基因*3/*3型；D：CYP2C19基因*1/*2型；E：CYP2C19基因*1/*3型；F：CYP2C19基因*2/*3型）Figure 2Hybridization results for CYP2C19 gene chip（A：CYP2C19*1/*1 genotype；B：CYP2C19*2/*2 genotype；C：CYP2C19 *3/*3 genotype；D：CYP2C19*1/*2 genotype；E：CYP2C19*1/*3 genotype：F：CYP2C19*2/*3 genotype）

表2 方法比對研究結(jié)果Table 2Results of method comparison study

3 討論

本研究中顯色型基因芯片技術(shù)主要原理是基于生物素標記的擴增產(chǎn)物與探針雜交后，生物素可以與鏈親和素堿性磷酸酶復(fù)合物結(jié)合，形成一種三元復(fù)合物（AP）。該復(fù)合物可以催化如下的顯色反應(yīng)，從而在擴增產(chǎn)物與探針雜交結(jié)合的部位產(chǎn)生藍紫色色斑得以識別：

AP+BCIP→BCI-OH+Pi；BCI-OH+NBT→藍紫色沉淀

式中BCIP為5-溴-4-氯-3-吲哚酸；NBT為硝基藍四氮唑。所形成的色斑很穩(wěn)定，室溫放置一年沒有明顯變化。此外，生物素、鏈親和素堿性磷酸酶復(fù)合物、BCIP、NBT等原料來源廣泛，價格低廉。更重要的是，色斑信號的檢測設(shè)備成本低廉、性能穩(wěn)定可靠。這對于產(chǎn)業(yè)化是至關(guān)重要的。與熒光檢測原理相比，顯色型原理不足之處在于檢測時間會由于顯色步驟增加1 h而略長，對醛基修飾載玻片的附著力要求較高。

顯色型基因芯片在探針結(jié)構(gòu)設(shè)計上，為便于探針固定在醛基基片上，探針的5'端進行氨基修飾；為保證探針與擴增產(chǎn)物雜交反應(yīng)的充分性，減小反應(yīng)的空間位阻，在探針與氨基之間還可以包含一段5～25聚的聚脫氧胸苷酸。

對于芯片陣列的設(shè)計，必須考慮有助于克服點樣誤差、實驗偏差、軟件自動分析結(jié)果時可能出現(xiàn)誤判的各種可能。通常將陽性對照探針按一定規(guī)則排布，便于軟件自動對陣列的定位、尋點、采集信號。每個探針點的重復(fù)次數(shù)最好不少于3次，取平均值可克服點樣誤差。本研究每個探針重復(fù)6次，交叉排列，除有利于克服點樣誤差，還可發(fā)現(xiàn)由于實驗偏差導(dǎo)致的信號不均勻分布產(chǎn)生的誤判。

采用接觸式點樣設(shè)備，必須避免點樣針清洗不徹底帶來的交叉污染，這會導(dǎo)致無法消除的非特異信號。本研究使用的點樣設(shè)備，點樣針必須每次清洗3 s，抽真空3次，且重復(fù)3次，才能保證多個探針間不交叉污染。

評價基因芯片性能的方法和指標必須與實際應(yīng)用相對應(yīng)。臨床檢驗關(guān)心的性能指標主要包括：準確性、靈敏性、特異性、重復(fù)性、抗干擾性、穩(wěn)定性等。評價上述指標時，應(yīng)當使用真實的臨床樣本，而不建議使用質(zhì)粒。質(zhì)粒比基因組小很多，純度高，試驗結(jié)果與真實樣本差異很大。另外，選擇評價樣品的基因型時，應(yīng)當根據(jù)評價指標作合理取舍。例如評價靈敏性時，宜選擇雜合型樣本。同等濃度下與純合子相比，雜合型樣本等位基因的拷貝數(shù)減半，對擴增的影響更大。評價重復(fù)性時，選擇中等濃度DNA更有代表性。

本研究建立的CYP2C19顯色型基因芯片及配套試劑已經(jīng)于2009年9月獲得國家食品藥品監(jiān)督管理局頒發(fā)的III類體外診斷試劑產(chǎn)品注冊證書［國食藥監(jiān)械（準）字2013第3400956號］，經(jīng)過4年多的臨床推廣應(yīng)用，已經(jīng)在100多家三甲醫(yī)院用于臨床氯吡格雷等藥物個體化治療的指導(dǎo)［8-10］。應(yīng)用顯示，顯色型基因芯片方法簡便可靠，性能穩(wěn)定，極具性價比優(yōu)勢。不僅體現(xiàn)了技術(shù)創(chuàng)新對產(chǎn)業(yè)發(fā)展的現(xiàn)實推動，也為臨床基因診斷技術(shù)的發(fā)展提供了一種新的選擇。

志謝感謝上海長征醫(yī)院、復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院、上海市第一人民醫(yī)院檢驗科為本研究提供臨床樣本和臨床研究。

［1］Promyslov MSh，Kapytovskaia IN.Several methodolic features of determining cerebral gamma-aminobutyric acid.Vopr Med Khim，1977（1）：139-141.

［2］Kim IJ，Kang HC，Park JH，et al.RET oligonucleotide microarray for the detection of RET mutations in multiple endocrine neoplasia type 2 syndromes.Clin Cancer Res，2002，8（2）：457-463.

［3］Debouck C，Goodfellow PN.DNA microarrays in drug discovery and development.Nat Genet，1999，21（1 Suppl）：48-50.

［4］Zhou J，Lü H，Kang XX.The genetic polymorphisms of CYP2D6 and CYP2C19 and personalized therapy.Chin Med Biotechnol，2009，4（4）：299-302.（in Chinese）

周健，呂虹，康熙雄.藥物代謝酶CYP2D6和CYP2C19的基因多態(tài)性與個體化治療.中國醫(yī)藥生物技術(shù)，2009，4（4）：299-302.

［5］Wang Q，Du YM，Zhang GJ，et al.Methodology comparison between pyrosequencingandSangersequencingassayindetecting CYP2C19*17 polymorphism.Chin Med Biotechnol，2014，9（3）：222-224.（in Chinese）

王謙，杜亞梅，張國軍，等.焦磷酸測序法與Sanger測序法檢測CYP2C19*17基因多態(tài)性方法學(xué)對比研究.中國醫(yī)藥生物技術(shù)，2014，9（3）：222-224.

［6］de Morais SM，Wilkinson GR，Blaisdell J，et al.The major genetic defectresponsibleforthepolymorphismofS-mephenytoin metabolism in humans.J Biol Chem，1994，269（22）：15419-15422.

［7］de Morais SM，Wilkinson GR，Blaisdell J，et al.Identification of a newgeneticdefectresponsibleforthepolymorphismof（S）-mephenytoin metabolism in Japanese.Molecular Pharmacol，1994，46（4）：594-598.

［8］Liu Q，Dang DS，Chen YF，et al.The influence of omeprazole on platelet inhibition of clopidogrel in various CYP2C19 mutant alleles. Genet Test Mol Biomarkers，2012，16（11）：1293-1297.

［9］Liu Y，Liu N，Li W，et al.Relationship of CYP2C19*2 and CYP2C19*3 gene polymorphism with clopidogrel response variability and recurrent cardiovascular events in Chinese patients undergoing percutaneous coronary intervention.Pharmacology，2013，91（3-4）：165-172.

［10］Lozano-Ortiz R，Marin-Lacasa R，Pascual-Garcia A，et al.Therapeutic monitoring of escitalopram by dexamethasone suppression test.Actas Esp Psiquiatr，2012，40（5）：275-280.

MethodsGenomic DNAis extracted from peripheral blood samples anticoagulated with EDTA.The DNAfractions were amplified by PCR and hybridized with the probes of CYP2C19*2 and CYP2C19*3 mutant alleles on the CYP2C19 gene chip on 43℃.Afterwashing and developing the gene chip，the hybridization results were observed through gene chip scanning machine with Arraydoctor2.0 software.

ResultsThe detection limit of CYP2C19 colorful gene chip is 20 ng genomic DNA；Negative control groups which is hybridized with equal concentration of Salmon sperm DNA show no bands；The measurement of samples of*2/*2，*1/*3 genotype alleles are repeated 10 times and the results are also consistent.Triglyceride，cholesterol，bilirubin and hemolysis which are contained in blood samples have no influence to the results.1000 clinical samples were detected by clinical laboratory from three hospitals.The detection results from gene chip were same as sequencing results.

ConclusionOur study provides a technological meaning for clinical application using high-throughput gene detection related to personalized medicine.

Study of colorful gene chip for CYP2C19 genotyping

XING Jun-fen，WANG Tao，ZHANG Ying，ZHU Bin

ObjectiveGene microarray as a new kind of genetic diagnosis technology has been applied in clinical examination.Currently，probe-target hybridization is usually detected and quantified by detection of fluorophore with several shortages，such as raw materials，expensive testing equipment and unstable detection signal.Here，we try to build a method detected by coloration for quickly detecting the genotypes of CYP2C19.

Microchip analytical procedures；Polymorphism，single nucleotide；Genotyping techniques；CYP2C19

ZHU Bin，Email：zhubin@baio.com.cn

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2015.01.008

上海市科技型中小企業(yè)創(chuàng)新基金（1202H133200）；上海市徐匯區(qū)高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)項目（創(chuàng)新類）（2014010033）

200233上海百傲科技股份有限公司研發(fā)中心

朱濱，Email：zhubin@baio.com.cn

2014-05-22

www.cmbp.net.cn中國醫(yī)藥生物技術(shù)，2015，10（1）：39-44

AuthorAffiliation:Shanghai BaiO Technology Co.Ltd，Shanghai 200233，China

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol，2015，10（1）：39-44