BRCA1在乳腺癌細胞系中負調控miR-146a并抑制其促癌功能

李丹，康南，張維敏，詹啟敏

·論著·

BRCA1在乳腺癌細胞系中負調控miR-146a并抑制其促癌功能

李丹，康南，張維敏，詹啟敏

目的 在乳腺癌細胞系中，研究 BRCA1 基因對 miR-146a的調控，以及 miR-146a 的細胞學功能。

方法 采用 Western blot 和實時定量 PCR 檢測 BRCA1基因對 miR-146a 的調控；利用生物信息學分析軟件對BRCA1 以及 miR-146a 的相互調控進行分析；運用 MTS、克隆形成、Transwell 等實驗技術檢測 miR-146a 高表達及敲降對 MCF-7 細胞生長增殖、侵襲遷移等能力的影響。

結果 該研究發現 BRCA1 缺失的情況下，miR-146a 表達顯著表達升高。通過對 miR-146a 啟動子區分析發現BRCA1 可以與 miR-146a 啟動子區結合并調控其表達，同時 miR-146a 可以與 BRCA1 3'UTR 不完全互補結合，這提示 BRCA1 對 miR-146a 的調控是一種負反饋作用機制。該研究還發現 miR-146a 高表達可以促進細胞生長增殖和侵襲遷移的能力，而 miR-146a 敲降后卻可以抑制細胞這些表型。

結論 在乳腺癌細胞中，BRCA1 通過負調控 miR-146a 的表達來抑制其促癌功能。

微 RNAs； 基因，BRCA1； 基因表達調控，腫瘤

BRCA1 是一種常見的與家族遺傳性乳腺癌和卵巢癌有關的抑癌基因［1］，在乳腺癌中常存在低表達，并且與惡性程度相關［2］。BRCA1 基因定位于人類第十七號染色體，由 24 個外顯子組成，編碼一個由 1863 個氨基酸組成的分子量為 220 kD 的蛋白［3］。許多研究表明 BRCA1 參與細胞和生命活動中重要的進程如細胞周期調控、DNA 損傷修復、轉錄調控及泛素化降解等過程［4］，如 BRCA1 通過同源重組的方式參與細胞 DNA 損傷修復過程，當DNA 受到損傷后，BRCA1 蛋白改變原來散在的分布于細胞核中的狀態而匯集到 DNA 損傷位點如 R-loops 上，導致轉錄終止來完成 DNA 損傷修復［5］。另外，BRCA1 還具有泛素化連接酶的活性，催化底物蛋白 FANCD2、NPM 及 γPMCD2 連接酶等，從而參與到 DNA 損傷修復等生物學過程中［6］。

MicroRNA 是一類重要的非編碼小 RNA，通過與靶 mRNA 的特異性結合介導靶mRNA 的降解或翻譯抑制［7］。MicroRNA 參與調控復雜的基因網絡，包括生物進化、胚胎發育、細胞分化、細胞增殖、信號轉導等多種生命活動［8-10］。大量研究表明，microRNA 表達的改變會引起一些重要生物學過程的異常調控從而引起疾病甚至腫瘤的發生［11-13］，因此 microRNA 可被看作是一類新的抑癌基因和癌基因，通過形成復雜的調控網絡來影響腫瘤的發生和發展［14］。MicroRNA 表達譜在人類腫瘤中的變化，可以作為對腫瘤進行分類及診斷的有效方法［15］。研究發現，多于 60% 的細胞 mRNA 是受到 microRNA 調控的，BRCA1 基因也不例外［16］。BRCA1 基因的 3′UTR 長約 1.5 kb，可以與 20 ～200 個 microRNA 結合［17-18］，其中 miR-146a 是調控 BRCA1 基因的一個重要的 microRNA，它可以與 BRCA1 基因的 3'UTR 互補結合從而調控BRCA1 基因的表達［19-20］。目前根據啟動子區分析研究發現多種轉錄因子，包括 NF-κB、IRF3/IRF7、C/EBPI 等，可通過結合 miR-146a 啟動子區調控miR-146a 的表達［21］。

本研究發現在 BRCA1 基因失活的情況下，miR-146a 表達顯著升高。通過啟動子區相關分析發現，BRCA1 基因可以與 miR-146a 的啟動子區結合，并調控 miR-146a 的表達，我們又在 MCF-7中檢測了 miR-146a 對細胞生長增殖、遷移侵襲的影響，旨在揭示 BRCA1 基因在乳腺癌中對miR-146a 的調控功能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞培養 293 sh control、293 shBRCA1、MCF-7 sh control、MCF-7 sh BRCA1、MEF BRCA1+/+、MEF BRCA1-/- 及 MCF-7 采用 90% DMEM 培養基加 10% 胎牛血清，于 37 ℃，5% CO2孵箱中培養。

1.1.2 儀器 7300 熒光定量 PCR 儀為美國ABI 公司產品；iMark 酶標儀購自美國 Bio-Rad公司；GeneGenius 全自動凝膠成像儀購自英國Syngene 公司；ImageQuant LAS4000 超靈敏發光成像分析儀購自美國 GE 公司；BX51 顯微鏡購自Qlympus 公司。

1.2 方法

1.2.1 實時定量 PCR 提取 MCF-7 細胞的總 RNA，進行逆轉錄，實時定量 PCR步驟根據 SYBR-Green 半定量進行，每次試驗重復至少3 次。其反應體系如下：1 × SYBR-Green Premix EX Taq 試劑、50 ng DNA、基因引物 0.1 μmol/L，終體積為 20 μl。反應條件為 95 ℃ 30 s、95 ℃ 5 s、60 ℃ 31 s，共 40 個循環。通過分析產物的溶解曲線來確定擴增的特異性。采用的特異性引物miR-146a 和內參 U6 均由廣州市銳博生物科技有限公司合成。其中 miR-146a 引物是銳博生物科技有限公司提供的試劑盒 Bulge-loopTMqPCR Primer Set，序列沒有公開；內參 U6 引物上游：CTCGCTT CGGCAGCACA，下游：AACGCTTCACGAATTTG CGT。

1.2.2 Western blot 提取 MCF-7 細胞的總蛋白，按蛋白分子量要求制備相應濃度的 SDS-PAGE分離膠和積層膠，待積層膠層凝固后，小心地拔出梳子，反復沖洗上樣孔，將凝膠玻璃板固定于電泳裝置上，加入 1 × Tris-甘氨酸電泳緩沖液，加樣孔用電泳緩沖液沖洗后上樣，之后先以 80 V 電壓電泳，當染料前沿到達分離膠與積層膠交界時，調電壓至 100 ～ 120 V 電泳，直至染料到達最下沿，然后進行濕轉轉膜，恒流 0.3 A 左右轉膜 2 h 左右，之后蛋白免疫印跡進行一抗及二抗的孵育，最后進行曝光。

1.2.3 瞬時轉染 取對數生長期 MCF-7 細胞接種于相應培養皿中，將 miR-146a mimic，inhibitor和陰性對照轉入細胞，轉染步驟參照LipofectamineTM2000 試劑盒說明書。其中miR-146a mimic，inhibitor 和陰性對照由廣州市銳博生物科技有限公司合成。

1.2.4 MTS 和克隆形成實驗 ①MTS：將轉染48 h 的 MCF-7 細胞消化，計數，接種于 96 孔板中，每孔加 200 μl 含 2000 個細胞的 10% 胎牛血清的 DMEM 培養基，每組做 5 個復孔，種 4 個96 孔板（分別為 0、24、48、72 h）每次測之前將培養基換成含 1% ～ 2% MTS 的培養基（避光），37 ℃、5% CO2孵箱中孵育 0.5 ～ 1 h，取出，用iMark 酶標儀選擇波長 490 nm 為檢測光，630 nm為參照光，測細胞的 MTS 值，計數，計算每組的平均值，細胞的生長快慢與 MTS 值成正比。②克隆形成實驗：將轉染 48 h的細胞消化，計數，以每皿 500 ～ 1000 個細胞接種于 60 mm 的培養皿中，每組做 3 ～ 4 個重復，培養 7 ～ 10 d，每個細胞克隆球里面單個細胞數大于 50 時，收細胞，用1 × PBS 洗 2 次，再用甲醇固定 5 ～ 10 min，之后用結晶紫染 15 ～ 20 min，晾干，用儀器拍照并計數，計算每組的平均值。

1.2.5 Transwell 實驗 細胞侵襲實驗：將基質膠在 4 ℃ 融化，用無血清 DMEM 培養基配制 2%的基質膠，將配好的膠鋪到 24 孔 Transwell 上室，每孔 100 μl，孵育過夜，將轉染 36 h 后的MCF-7 細胞用無血清的 DMEM 培養基饑餓 6 ～8 h，消化的細胞用無血清的 DMEM 培養基洗2 遍，以每孔 200 μl 含 105個細胞的 10% 胎牛血清的 DMEM 培養基接種于 24 孔 Transwell上室，在下室中加入 600 μl 含 20% 胎牛血清的DMEM 培養基，于 37 ℃、5% CO2孵箱中培養20 h，用甲醇固定 Transwell 小室 1 min，結晶紫染色 5 min，將小室放入水中沖洗一下，再用棉棒擦去小室內底部表面的細胞，用正置熒光顯微鏡（10 倍）拍照，每孔選擇 9 個視野，計數，計算每組小室細胞的平均數。

1.3 統計學處理

通過 GraphPad Prism 5 軟件在 windows7 平臺下進行統計學處理，符合正態分布的計量資料用±s表示，組間比較采用 t 檢驗，P ＜ 0.05 的差異被認為具有統計學意義。

2 結果

2.1 BRCA1 表達的缺失增加 miR-146a 在各種細胞系中的表達量

在多種細胞系中，通過 Western blot 檢測BRCA1 的蛋白表達量，如圖 1A 所示；在上述細胞系中通過實時定量 PCR 檢測 miR-146a 的表達量，發現 BRCA1 基因失活的情況下，miR-146a 表達顯著升高，如圖 1B 所示。

圖1 在不同細胞系中，BRCA1 和 miR-146a 的表達量（A：Western blot 檢測 BRCA1 在細胞系中的表達量，其中 β-actin作為對照；B：實時定量 PCR 檢測轉染 miR-146a 在細胞系中的表達量，miR-146a 表達量標準化到 U6；*P ＜ 0.05）Figure 1 BRCA1 and miR-146a expression in different cell lines （A： The expression of BRCA1 and β-actin was detected by Western blot with the corresponding antibodies. β-actin was used as loading control； B： miR-146a expression inversely correlates with BRCA1 expression in different cell lines. The expression of miR-146a was detected by qRT-PCR and normalized to U6；*P ＜0.05）

圖2 BRCA1 與 miR-146a 啟動子區的結合序列及 miR-146a（A）與 BRCA1 的 3'UTR 結合位點（B）Figure 2 BRCA1-binding regions on miR-146a promoter （A） and miR-146a is downstream of BRCA1 （B）

2.2 BRCA1 與 miR-146a 生物信息學研究

通過生物信息學方法，發現人類 miR-146a 位于 5 號染色體上的 LOC285628 中，進一步分析兩個 ESTs encompassing LOC285628，發現這兩個基因包含兩個外顯子，中間有 16 kb 基因序列斷開，且 miR-146a 位于第 2 個外顯子中，如圖 2A所示（數據來源于 JASPAR database）；而 miR-146a可以與 BRCA1 3'UTR 不完全互補的結合，如圖2B 所示（數據來源于 miRbase）。

2.3 MCF-7細胞系中轉染 miR-146a mimic 和inhibitor 后 miR-146a的表達量

在 MCF-7 細胞中轉染 miR-146a mimic 和inhibitor 后其檢測 miR-146a 的 RNA 水平的表達量會有差異（圖 3），real-time PCR 結果提示轉染 miR-146a mimic 和 inhibitor 與對照組相比分別會增加和降低 miR-146a 在細胞中的表達量，且具有統計學意義，P 值分別為 0.0011 和 0.0027。

2.4 miR-146a 高表達及低表達對 MCF-7 細胞生長增殖的影響

將 miR-146a mimic 和 inhibitor 轉入 MCF-7細胞后，檢測其對細胞生長增殖的影響，圖 4A 是MTS 檢測細胞生長，繪制細胞生長曲線，結果發現在 48 h 時轉染 miR-146a mimic 組的生長速率相對于實驗組明顯升高，P = 0.027，存在統計學差異（P ＜ 0.05），而轉染 miR-146a inhibitor 組的生長速率相對于實驗組降低得并不明顯；72 h 時轉染miR-146a mimic 組的生長速率相對于實驗組明顯升高，P = 0.017，具有統計學差異（P ＜ 0.05），而轉染 miR-146a inhibitor 組的生長速率相對于實驗組明顯降低，P = 0.028，有顯著差異；96 h 時miR-146a mimic 組的生長速率相對實驗組明顯升高，P = 0.007，具有顯著統計學差異（P ＜ 0.01），而轉染 miR-146a inhibitor 組的生長速率相對于實驗組明顯降低，P = 0.037，有顯著差異（P ＜ 0.05），這說明高表達 miR-146a 能夠促進細胞生長，抑制后抑制細胞生長。

圖3 Real time PCR 檢測轉染 miR-146a mimic 和inhibitor 后 miR-146a 的表達量（**P ＜ 0.01）Figure 3 The expression of miR-146a in MCF-7 cell line after transfected with miR-146a mimic and inhibitor （**P ＜0.01）

圖4 高表達 miR-146a 促進 MCF-7 細胞生長增殖能力（A：MTS 檢測 miR-146a 對細胞生長的影響；B：克隆形成試驗檢測 miR-146a 對細胞增殖的影響；*P ＜ 0.05 和**P ＜ 0.01）Figure 4 miR-146a overexpression results in increased proliferation and colony formation in MCF-7 cell line ［A： Relative cell proliferation （as measured by the MTS assay） of MCF-7 cell transfected with miR-146a mimic and inhibitor； B： Colony images taken after 7 - 10 d of MCF-7 cell transfected with miR-146a mimic and inhibitor are shown；*P ＜ 0.05 and**P ＜ 0.01］

圖 4B 是克隆形成實驗檢測細胞增殖，其中對照組克隆數為（96 ± 17）個，miR-146a mimic 組為（185 ± 58）個，其中 P = 0.035，差異具有統計學意義（P ＜ 0.05）；而 miR-146a inhibitor 組為（70 ± 16）個，相對于對照組 P = 0.042，差異具有統計學意義（P ＜ 0.05），這說明高表達 miR-146a 能夠促進 MCF-7 細胞生長增殖，抑制其表達后具有抑制MCF-7 細胞生長增殖的能力。

2.5 miR-146a 高表達及低表達對 MCF-7 細胞侵襲轉移的影響

將每孔 105個 MCF-7 細胞接種于 Transwell小室經 20 h 培養后計數并計算每個小室平均值，在遷移試驗中，對照組細胞數平均為（56 ± 17）個，miR-146a mimic 組平均為（89 ± 26）個，兩者相比具有統計學差異 P = 0.022（P ＜ 0.05），而 miR-146a inhibitor 組為（36 ± 14）個，相對于對照組 P = 0.023，差異具有統計學意義（P ＜ 0.05）；在侵襲試驗中，對照組細胞數平均為（53 ± 12）個，miR-146a mimic 組平均為（76 ± 14）個，兩者相比具有明顯統計學差異 P = 0.005（P ＜ 0.01），而 miR-146ainhibitor 組為（36 ± 9）個，相對于對照組 P = 0.014，差異具有統計學意義（P ＜ 0.05）。結果說明高表達miR-146a 能夠促進細胞生長遷移和侵襲能力，抑制其表達后抑制細胞遷移和侵襲能力。

圖5 Transwell 試驗檢測 miR146a 對 MCF-7 細胞遷移、侵襲能力的影響（*P ＜ 0.05 和**P ＜ 0.01）Figure 5 miR-146a positively modulates MCF-7 cell migration and invasion. MiR-146a increased cellular motility of MCF-7 cell. Representative pictures （top） and quantitative data （down） of Transwell （migration or invasion） assays （*P ＜ 0.05 and**P ＜ 0.01）

3 討論

BRCA1 是世界上首個被發現的家族遺傳性乳腺癌抑癌基因，攜帶突變 BRCA1 基因的人罹患乳腺癌和卵巢癌的風險將極大升高［1］。近年來發現BRCA1 可以與多個 miRNA 結合［17-18］，其中miR-146a 是調控 BRCA1 基因的一個重要的miRNA，它可以與 BRCA1 基因的 3'UTR 互補結合從而調控 BRCA1 基因的表達［19-20］。miRNAs 是一些由內源性基因編碼的長度約 22 nt 的單鏈非編碼 RNA，它們的靶向序列一般由 2 ～ 8 個核苷酸與 mRNA 3'UTR 的 5' 端或“seed region”互補結合來調控基因的表達，從而阻止靶 mRNA 的翻譯或者直接降解靶 mRNA［7］。目前已經發現真核生物 miRNAs 參與基因表達調控，miRNA 參與調控復雜的基因網絡，如細胞的凋亡、增殖、分化等［8-10］，這說明 miRNA 既可以作為癌基因（mir-17-92 cluster）也可作為抑癌基因（miR-3a）發揮功能［14］。本研究發現在 BRCA1 低表達的情況下，miR-146a的表達量顯著升高。通過 JASPAR database 對miR-146a 啟動子區進行預測，發現 BRCA1 可以與 miR-146a 的啟動區結合。有研究表明，BRCA1 是 miR-146a 的靶基因，我們通過 TargetScan、miRbase 等數據庫也發現 BRCA1 的 3'UTR 存在與 miR-146a結合的“seed region”，這提示 BRCA1調控 miR-146a 是一種負反饋方式，但 BRCA1 調控 miR-146a 的具體機制目前還無明確報道，這也為以后的研究提供依據和思路。有研究發現miR-146a 在多種腫瘤中存在異常表達，miR-146a可以靶向細胞黏附分子 L1，并抑制胃癌細胞（MKN-45 cell）的轉移能力［22］；miR-146a 的多態性與前列腺癌的發病風險有關［23］；miR-146a 可以作為結直腸腫瘤定位的一個生物標志物［24］；miR-146a 的 SNP 可以作為非黑色素瘤皮膚癌的一個易感因素［25］；miR-146a 的多態性促進口腔鱗狀細胞癌起始和發展［26］；在甲狀腺濾泡癌中pre-miR-146a 低表達［27］，因此提示 miR-146a 是一種與腫瘤相關的 miRNA，但是目前 miR-146a 在乳腺中的功能還不明確。在本研究中我們通過構建miR-146a mimic 和 inhibitor，轉入乳腺癌細胞MCF-7 中，采用 MTS 描繪細胞生長曲線，克隆形成試驗，Transwell 試驗檢測 miR-146a 對細胞生長增殖、遷移侵襲的影響，結果發現 miR-146a高表達可以促進 MCF-7 細胞生長增殖、遷移侵襲，這說明 miR-146a 作為一種癌基因發揮作用，同時，miR-146a 可能成為疾病診斷的新的標志物或者藥物靶點，從而為人類疾病及腫瘤的預防、診斷和治療提供一種新的手段。

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Methods Western blot and real time PCR assays were performed to examined the regulation of BRCA1 on miR-146a.

Bioinformatics tools were applied to analyze the bidirectional regulation between BRCA1 and miR-146a. MTS， colony formation，transwell assays were selected to test the effects of miR-146a mimic and inhibitor on cell growth and proliferation， migration and invasion of MCF-7 cells.

Results The loss of endogenous BRCA1 greatly attenuated the expression of miR-146a. By means of promoter analysis， the results showed that BRCA1 was able to bind the promoter region of miR-146a and regulate its expression， while miR-146a could be partially complementary to bind BRCA1 3'UTR， suggesting that BRCA1 modulated miR-146a in a negative feedback mechanism. miR-146a mimic promoted the ability of cell growth， proliferation， migration and invasion， while miR-146a inhibitor had the reversed function. Conclusions BRCA1 negatively regulates miR-146a and inhibits its tumor promoting functions in breast cancer cells.

BRCA1 negatively regulates miR-146a and inhibits its tumor promoting functions in breast cancer cells

LI Dan， KANG Nan， ZHANG Wei-min， ZHAN Qi-min

Objective To investigate the regulation of BRCA1 on miR-146a and the biological functions of miR-146a in breast cancer cells.

MicroRNAs； Gene， BRCA1； Gene expression regulation， neoplastic

ZHAN Qi-min， Email： zhanqimin@pumc.edu.cn

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2015.03.002

中國醫學科學院腫瘤醫院院所基本科研業務費（JK2011B22）

100021 北京，中國醫學科學院腫瘤醫院/北京協和醫學院分子腫瘤學國家重點實驗室

詹啟敏，Email：zhanqimin@pumc.edu.cn

2015-04-06

www.cmbp.net.cn 中國醫藥生物技術， 2015， 10（3）：196-202

Author Affiliation： State Key Laboratory of Molecular Oncology， Cancer Hospital， Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College， Beijing 100021， China

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol， 2015， 10（3）：196-202