測序技術發展狀況及相關專利分析

毛舒燕，梁婧文

測序技術發展狀況及相關專利分析

毛舒燕*，梁婧文*

基因是生物體的遺傳信息載體，其遺傳和表達影響生物體的繁衍及各種生命活動。對于人類而言，個體基因組DNA 序列突變往往會導致疾病的發生，獲取個體的基因組DNA 信息將有助于疾病的預防、診斷和治療［1］。正因如此，科學家們奉獻了無數心血研究 DNA 或RNA 測序技術，以期解密這些神奇的生命密碼。于此同時，基因測序所帶來的巨大經濟利益也使得更多科研機構和企業積極投身于這項改變世界的事業，企業乃至國家之間的競爭愈演愈烈。

1 專利申請概況

1.1 DNA 測序技術全球專利申請趨勢

自 20世紀 80 年代，開始有 DNA 測序技術的相關專利申請提出。以 WPI 數據庫中專利申請的最早優先權日和最早公開日統計，自 1984 年起，全球 DNA 測序技術相關專利申請共計 1257 項；通過分類號和人工瀏覽去噪，針對測序方法、設備和試劑的專利申請共計 344 項（圖 1數據截至 2014 年 9 月 14 日）［2］；這期間出現了兩個高潮階段，主要集中在 1998 - 2004 年和 2006 - 2013 年，正好對應了第二代和第三代測序技術的興起。

第一代測序技術出現于 20世紀 70 年代，專利申請相對較少，直至 1995 年第一臺測序儀上市以及人類基因組測序計劃的啟動和進行，人們逐漸意識到現有測序技術的不足之處，也認識到測序技術在疾病診斷領域的巨大價值，專利的申請量逐漸增多。至 2000 年前后，第二代 DNA 測序技術興起，短時間內的專利申請量急劇升高，指征著有關DNA 測序的核心技術或理念的出現，以及人們對于 DNA測序技術發展的集中關注。第三代 DNA 測序技術興起于2006 年后，相關專利產出量基本延續了 1998 - 2004 年之間的快速增長趨勢，維持著較高的專利產出水平，反映出DNA 測序技術的研究熱度仍在延續。

圖1 近 30 年來全球測序技術相關專利年度申請量趨勢

圖2 DNA 測序技術全球重要專利技術產出地

1.2 DNA 測序技術專利產出分布

專利申請的優先權國別/地區和最早申請國別/地區通常是該項專利技術的研發地，通?？烧J為是該項技術的產出地，體現了各國家或地區的科研實力以及專利保護意識的強弱［2］。圖 2 展示了 DNA 測序技術的專利產出地分布情況，數據顯示，美國、日本、歐洲專利局（是指首次申請是通過歐洲專利局遞交，這部分專利申請主要來自歐盟國家）、英國和韓國的專利申請量分列全球前 5 位，其中美國的申請量遠超過其他國家，占全球前十位國家總申請量的 57.8%，這說明 DNA 測序技術領域呈現出美國一家獨大的態勢。因此，做 DNA 測序技術相關的研發，對美國專利進行分析和研究都是非常必要的。而我國在該領域專利申請量位列全球第 6，表明我國具有一定的科研能力，專利保護意識也在逐漸加強。

2 技術發展歷程

測序技術最早可以追溯到 20世紀 50 年代，早在1954 年就已經出現了關于早期測序技術的報道，圖 3 展示了測序技術的基本發展歷程。

2.1 第一代測序技術——鏈終止法和化學降解法

2.1.1 鏈終止法 1975 年由桑格（Sanger）和考爾森（Coulson）開創了鏈終止法（dideoxy chain-termination method）。其核心原理是：由于 ddNTP 的 2' 和 3' 位都不含羥基，其在 DNA 的合成過程中不能形成磷酸二酯鍵，因此可以用來中斷 DNA 合成反應，在 4 個 DNA 合成反應體系中分別加入一定比例帶有放射性同位素標記的ddNTP，通過凝膠電泳和放射自顯影后可以根據電泳帶的位置確定待測分子的 DNA 序列［3］。

2.1.2 化學鏈降解法 1976 - 1977 年馬克西姆（Maxam）和吉爾伯特（Gilbert）發表了化學測序法（鏈降解），此項方法基于對核堿基特異性地進行局部化學改性，接下來在改性核苷酸毗鄰的位點處 DNA 骨架發生斷裂，由于經純化的 DNA 可被直接使用，馬克西姆-吉爾伯特測序法迅速得到了推廣。但由于其技術復雜、大量使用危險藥品及難于擴大規模的缺陷，逐漸被市場淘汰。

2.1.3 鳥槍法 1980 年，桑格又發明了“鳥槍法測序”，將大分子 DNA 片段隨機打斷成小片段，分別測序后，再利用小片段之間的重疊段進行拼接，從而讀出原來的長片段的序列［4］。該技術為第二代測序技術的發展奠定了技術基礎。

第一代測序技術最大的貢獻在于，在 2001 年完成了首個人類基因組圖譜。但因其成本高、速度慢、通量低，且需要大量專業技術人員全程操作等不足，隨著時代的進步，越來越無法滿足科學研究和生產應用的需要。

2.2 第二代測序技術——邊合成邊測序

2.2.1 GS FLX 系統 GS FLX 系統的關鍵技術在于單鏈DNA 結合在水油包被的直徑約 28 μm 的磁珠上進行獨立的 PCR 反應。其測序原理是基于焦磷酸測序法，通過檢測每一個聚合 dNTP 攜帶的熒光信號對 DNA 序列進行實時檢測。該技術核心專利申請 WO02077287 于 1999 年提出（最早優先權日），請求保護用于 DNA 測序的裝置和方法，對其核心技術進行了全面的展示和披露。

2.2.2 Solexa 和 Hiseq系統 Solexa 和 Hiseq 系統的關鍵技術在于利用單分子陣列實現在小型芯片（flow cell）上進行橋式 PCR 反應。在生成新 DNA 互補鏈時，由于新的可逆阻斷技術可以實現每次只合成一個堿基，并標記熒光基團，再利用相應的激光激發熒光基團，捕獲激發光，從而讀取堿基信息［4］。該技術在專利申請 WO9844151 中公開，專利申請 WO0063437中主要對檢測熒光信號的方法進行了保護。

2.2.3 SOLiD 系統 SOLiD 系統則以四色熒光標記寡核苷酸的連續連接合成為基礎，取代了傳統的聚合酶連接反應，用連接法測序獲得基于“雙堿基編碼原理”的 SOLiD 顏色編碼序列，使得每一個堿基都被檢測兩次，提高了系統準確性［4］。其核心專利申請 US4811218、WO9001562 和WO200713706 分別在 1989 年和 2006 年提出，請求保護了用于 DNA 測序的設備和方法。

第二代測序技術是迄今為止發展最為成熟、使用最為廣泛的 DNA 高通量測序手段，在基因組大規模測序和基因診斷治療中功不可沒，但是其不足也日益凸顯，如讀長較短，PCR 擴增偏差等。在這種情況下，以單分子測序技術為基礎的第三代測序技術應運而生。

2.3 第三代測序技術——單分子測序

圖3 DNA 測序技術發展歷程

2.3.1 并行單分子合成測序技術 該技術以 HelicosBiosciences 公司的 tSMSTM（true single molecular sequencing）技術平臺為代表，測序原理為：通過 DNA 剪切以及添加多聚 A 尾產生 DNA 片段，然后與固定在流動單元的poly-T 寡核苷酸進行雜交，對每個新添加的 dNTP 的熒光標記進行測序［5］。

2000 年至今，該公司申請基因測序相關專利申請多達51 項，涵蓋測序試劑、測序方法、測序設備、檢測方法等多個領域；相比于其他公司，該公司更側重于對測序試劑的改進研發，相關專利申請達 13 項之多。雖然其專利申請進入多個國家和地區，但并沒有在中國進行布局。

2.3.2 SMRT 技術 SMRT 技術是基于邊合成邊測序的思想，進行單分子實時測序，具體利用“零模式波導（zeromode wave-guides，ZMWs）”小孔測序芯片完成，該小孔直徑只有幾十個納米，激光無法直接穿過小孔，而會在小孔處發生衍射，通過檢測分散到各個 ZMW 小孔的 DNA片段的熒光標記來判定 dNTP 的種類［5］。

Pacific Biosciences 公司 SMRT 技術的核心專利申請為 WO2006083751，首次披露了測序所使用的芯片結構和熒光信號檢測方法；專利申請 WO2007019582、US2007206187、WO2007041342 分別對光學信號的監測方法和系統、設備、反應所使用的試劑進行了改進。2006 年后還有很多圍繞核心技術進行改進的專利申請，分別涉及DNA 聚合酶的錨定連接、熒光信號檢測方法、熒光染料、反應試劑等方面；2008 年專利申請量達到最高峰，全球范圍內共 116 件。

2.3.3 納米孔單分子技術 Oxford Nanopore Technologies公司研發的測序技術為水解測序法，其核心是基于納米孔單分子實時讀取技術，檢測單堿基短暫的影響流過納米孔的電流變化，從而檢測出 DNA 序列信息［5］。

Oxford Nanopore Technologies 公司自 2006 - 2007 年開始研發納米孔單分子測序技術，并在研究初期就提出專利申請，分別涉及脂質雙分子層結構（WO2009077734）、能夠穿透脂質雙分子層進行電學信號傳導的傳感器（WO2008102120）、核酸外切酶和孔的構建體（WO2010004265）、核酸外切酶的改造（GB0901751D0）等；直至 2010 年才公開了其核心專利申請 WO2010004273，具體保護了用于 DNA 測序的 Nanopore；并在此之后，逐步對其核心技術進行改進完善，包括脂質雙分子層結構的改進、Nanopore 測序平臺、計算方法的改進等。

2.3.4 基于 FRET的測序技術 基于熒光共振能量傳遞（fluorescence resonance energy transfer，FRET）的測序儀最初由 VisiGen Biotechnologies 公司開發，基本原理是先將被供體熒光基團修飾的 DNA 聚合酶和 DNA 模板分子固定在固體表面，在被不同顏色的受體熒光基團標記的核苷酸摻入時，會釋放一個 FRET 信號，使 DNA 分子發光，而發光的顏色則提示了堿基的類別［5］。涉及該技術的專利申請共 7 件，公開號為：WO2004059011、US7906280、US2007202521、KR20110132131、US2012219961、WO2011090745、WO0125480，申請人來自多個公司，其中僅有一件醫療生物系統有限公司的專利申請 CN1391615進入中國。

2.3.5 半導體測序技術 2010 年底 Ion Torrent 公司推出了一種基于半導體芯片的新一代革命性測序平臺—— Ion Torrent PGM。該測序平臺的技術核心為離子流半導體技術，即使用了一種布滿小孔的高密度半導體芯片，一個小孔就是一個測序反應池，當 DNA 聚合酶把核苷酸聚合到延伸中的 DNA 鏈上時，會釋放出一個氫離子，反應池中的 pH 發生改變，從而讀出 DNA 序列［6］。其測序過程是通過檢測H+信號的變化來獲得序列的堿基信息。該技術核心專利申請 5 件，公開號為 WO2010016937、WO2010138188、WO2010138187、WO2010047804、WO2010008480，涵蓋遞送試劑的流控系統、多步驟電化學反應的裝置、中心測序裝置、分析裝置、減噪方法等各個技術領域，并有 4 件核心專利申請進入中國。

通過上述第三代測序技術介紹可以看出，第三代測序技術因為不需要依賴 PCR 擴增，克服了 PCR 對測序的影響，很好地解決了第二代測序技術難以克服的重復片段的測序問題，技術優勢明顯，擁有更廣闊的應用前景。

2.4 第三代測序技術比較

圖4 第三代測序技術主要申請人分析

對上述第三代測序技術持有者的專利申請情況和其進入中國的專利申請數量（項）進行總結和比較發現（以上專利申請的檢索均在 Sipoabs 數據庫中完成，以申請人為檢索入口），大部分技術的核心專利申請都進入中國，但進入中國的專利申請占其專利申請總量比例較?。▓D 4）。Pacific Biosciences 公司無疑成為了第三代測序技術中的龍頭老大，而專利申請數量不多的 Ion Torrent 也獲得了較高的市場占有量，這同各個測序技術的優缺點、適用范圍、測序成本都有著密不可分的關系，表 1 詳細比較了第三代測序技術的性能和優缺點。

表1 第三代測序技術性能比較

表2 三代測序技術適用范圍比較

表3 主流測序平臺的測序成本比較

2.5 三代測序技術總結

表 2 選取代表性測序方法和平臺對比了三代測序技術的優缺點和適用范圍（第三代測序方法以 Ion Torrent 為例），該表反映出測序技術的發展脈絡和方向，也體現了測序技術應用的新需求，由大規?；蚪M測序到小規模染色體、轉錄組、直至具體基因的測序。而若要將測序技術推廣應用于疾病診斷，由患者買單，那么如何降低測序成本就成為了開發者必須攻克的難關。通過總結目前市場主流測序平臺的測序成本（表 3），也不難看出為何 Ion Torrent 能從第三代測序技術中脫穎而出，其測序成本的低廉無法不受到市場的青睞。

3 主要申請人分析

由圖 2 可看出，測序技術領域主要被國外申請人所占據，國內申請人涉足此行業時間較短，多為購買國外儀器設備進行下游應用和開發。因此，選取在測序技術領域占據龍頭地位的 Illumina、一直期望兼并 Illumina 并與之抗衡的Roche 和第三代測序儀的成功代表 Ion Torrent 作為重點申請人，對其技術開發歷程、專利申請情況、市場份額進行如下分析。

3.1 Illumina

Illumina 公司成立于 1998 年，最初是以基因分型和微列陣為主要技術和研發方向。經過 16 年的發展，該公司2014 年被評為“全球創新企業 50 強”。到目前為止，其擁有了基因組測序儀市場 70% 的份額，是名副其實的測序儀大鱷。作為創新企業榜首的 Illumina 公司非常重視其在全球范圍內的專利布局，不僅通過自主研發獲得專利技術，頻繁的收購活動也使其積累了大量的專利技術財富。其中最重要的一次收購即為 2007 年斥資 6 億美元購買了擁有先進基因測序技術的 Solexa 公司，收獲了其全部測序技術專利，并因此推出了其第一代的 Genome Analyzer 測序系統。隨后，又陸續收購了生產基因測序試劑的 Epicentre 公司（2011 年）、專注于染色體篩選診斷的 Bluegnome 公司（2012 年）、專注于繁殖和遺傳健康的 Verinata 公司（2013年）、專注微流樣品處理的 Advanced Liquid Logic 公司（2013 年）、專注于基因組信息學的 NextBio 公司（2013年）［7］。

截至 2014 年 3 月，在 Sipoabs 數據庫中，申請人Illumina 公司，包括其收購的其他公司，全球共申請 11259 件專利，專利數量呈逐年穩定增長態勢，并在美國、歐洲、中國均有專利布局。就專利技術領域分布而言，其專利涉及液滴操作、射流裝置、測試樣品儲存器件、測序系統、測試成像方法、樣品加熱器件、數據分析方法、核苷酸合成等與測序平臺相關的全方位的技術領域，完美體現了其技術的全面性及相應的知識產權保護的全面性。2010 年以后，Illumina相繼推出了升級后的 HiSeq 2000、HiSeq 2500 以及新一代小型 Miseq 高性能測序儀，進一步降低了測序成本，使得1000 美元測出全基因組序列成為可能。其中 Miseq 高性能測序儀更是因其卓越的性能和小型化的優勢，使其應用領域更加寬廣，受到更多非實驗室用戶的追捧。具有這些技術上的優勢，就不難解釋，Illumina 為何能夠坐擁基因組測序儀市場 70% 的份額，并讓其最大的競爭對手羅氏（Roche）不惜重金想要將其收入麾下［8］。

3.2 Roche

相比 Illumina，Roche 在測序技術領域的開拓則沒有那么順利。2007 年 3 月，羅氏診斷（Roche Diagnostics）與CuraGen 公司簽訂協議，以 1.55 億美元的現金和股票收購454 Life Science——超高通量基因組測序系統 Genome Sequencer 20 System 的擁有者。由于 GS FLX 測序系統具備高通量、高靈敏度、讀長較長、準確性高等優點，其甫一問世就獲得廣泛關注；但由于其高昂的使用費用，推廣應用受到局限。自 2008 - 2009 年，以 Heliscope、Nanopore、Ion Torrent 等為代表的第三代測序技術興起，其讀長可達1000 bp，準確率為 96% ～ 98%，測序通量較 GS FLX 小，但其每循環的耗時大大縮短，測序費用也更為低廉，這對GS FLX 測序市場造成了較大沖擊。羅氏雖沒有透露 454業務的收入情況，但隨著第三代測序技術銷量的上升，454測序儀已經被推到了市場邊緣。2013 年起，羅氏公司開始關閉 454 生命科學測序業務，并表示“454 測序儀將在2016 年被逐步淘汰”。

自 2010 年起，羅氏開始追趕新一輪的測序技術浪潮，與 IBM 和 DNA Electronics 結成聯盟，并在 2012 年初敵意收購 Illumina，不過 Illumina 拒絕了該收購要約；同年底，羅氏再次同 Illumina 進行協商，但交易仍未達成。羅氏與 IBM 和 DNA Electronics 的合作也并不長久，2013年即宣布結束，并停止了在半導體測序和納米孔測序技術上的研發努力。

種種挫折并沒有打消羅氏對測序新技術的追求渴望，并更加堅定地確信測序技術將在未來的生命科學和診斷領域扮演至關重要的角色。2013 年 9 月，羅氏與 Pacific Biosciences 達成協議，投資高達 7500 萬美元與 Pacific Biosciences 合作開發以 PacBio SMRT 技術為基礎的診斷產品。2014 年 6 月 2 日，羅氏宣布將以 1.25 億美元的現金和高達 2.25 億美元的里程碑費用收購美國納米孔測序公司的 Genia Technologies。

截至 2014 年 9 月，在 Sipoabs 數據庫中，以申請人ROCHE +、關鍵詞 sequenc + 為入口、以申請人 454 life tech+、Genia 為入口進行檢索發現，羅氏所擁有的 DNA 測序相關專利申請共有 103 項，核心專利全部進入中國。而其擁有的第三代 Genia 測序技術實質為單分子納米孔測序方法，有望降低測序成本，并提高測序的速度、準確性和靈敏度。

3.3 Ion Torrent

2010 年 10 月，美國《福布斯》雜志以封面文章報道了 Ion Torrent 公司企業家喬納森·羅森伯格（Jonathan Rothberg）和他發明的基因解碼器（decoder）。這種基于硅芯片的個人染色體檢測儀（personal genome machine，PGM）是當今世上體積最小、檢測成本最低的上市產品，可在 2 h之內，高精度解讀 1000 萬 nt，這款儀器的售價僅為 5 萬美元，是目前常用測序儀售價的 1/10。2011 年 5 月德國腸出血性大腸桿菌疫情爆發，華大基因組的科學家僅用三天的時間就完成了對這種新型細菌的基因組測序和分析，該項目的負責人稱，快速測序很大程度上得益于第三代測序儀Ion Torrent［4］。作為一家創業公司，Ion Torrent 非常重視其核心技術的知識產權保護，在 Sipoabs 數據庫中，以申請人為入口進行檢索，在從 2007 年到 2010 年 3 年間共申請了 11 項 45 件專利，其中有發明專利 7 項，多項專利申請分別進入了美國、英國、中國、日本、印度、新加坡等國。也正是因為看上其寶貴的專利技術資源，生物產業巨擘生命技術公司（Life Technologies）于 2013 年 8 月用價值3.75 億美元的資金和股票收購了 Ion Torrent。2014 年 2 月3 日 Thermo Fisher 宣布收購了生命技術公司。

4 我國測序技術發展現狀

作為生物基因產業鏈最上游的產業，基因測序技術的發展必將起到龍頭作用，不斷推動下游基因應用產業的發展，隨著基因檢測與醫療診斷的結合，其市場價值更是空前的高漲，成為各個國家及大型企業積極投資和發展的重要領域。

4.1 國內測序技術發展現狀

從上文的分析我們可以看出，新一代的高通量測序技術的研究開發和應用都被少數幾家歐美公司所壟斷，國內涉足此行業的機構多為購買國外大公司的儀器設備進行測序，具有中國自主知識產權的新一代高通量低成本測序技術系統的研發較為薄弱（以下專利申請的檢索均在 Sipoabs 數據庫中完成，以申請人為檢索入口）。

4.1.1 華大基因 做為國內測序企業的龍頭老大，華大基因擁有 137 臺 Illumina HiSeq 2000 測序儀、27 臺 ABI SOLiDTM4.0 System、羅氏 454 測序平臺和最新的 Ion Torrent 測序平臺，與美國 Broad 研究所、英國 Sanger 中心一起成為公認的世界最強的三大基因組研究機構［4］。雖然華大基因的主要測序平臺都購自國外公司，但其技術優勢在于擁有自主開發的數據分析軟件。截至 2014 年 8 月，華大基因擁有測序拼接、注釋、糾錯相關的核心技術專利12 件，涉及文庫構建、測序方法、數據分析的專利更是多達上百件，其中 PCT 申請 32件，使其在序列分析領域的力量不容小覷。與此同時，華大基因并沒有放棄測序儀領域的知識產權占有和開發，2013 年華大基因斥資收購美國Complete Genomics 公司的全部知識產權，以及 Life Tech公司的 Ion Proton 系統，進而推出了 BGISEQ-1000 和BGISEQ-100 兩款儀器，這兩款儀器均已通過 CFDA 批準用于臨床診斷。

4.1.2 華因康基因科技技術有限公司 同樣創立于深圳的華因康基因科技技術有限公司也積極投入新一代高通量基因測序系統研發。該公司研發的高通量測序技術平臺SeqExpert-IIIA 測序儀及 PSTAR-II 系列高通量基因測序系統，擁有 7 項美國專利，3 項 PCT 國際專利，16 項中國專利以及 22 項計算機軟件著作權［9］。上述專利申請涵蓋了測序儀、測序控制系統、測序方法及應用、生物樣品制備、生化試劑等多個技術項目，代表了目前國內最先進的測序技術，得以在新一輪的技術及市場競爭中與國際知名的基因產業大鱷相抗衡。

4.1.3 中國科學院基因組所 2013 年中國科學院基因組所和紫鑫藥業合作開發的第二代高通量測序系統項目正式簽訂了投資意向協議，意欲打造“中國芯”的測序系統，雖然該系統尚未面世，但其已經開始專利的布局。2012 - 2014年，共申請測序儀及其相關系統的核心專利 10 件，其中9 件都已經獲得中國國家知識產權局專利局的授權。

4.2 測序技術應用企業現狀

盡管我國擁有自主知識產權的基因測序公司較少，但是利用測序技術，尋求下游應用技術市場的企業比較多。我國作為全球人口最多的國家，在這一領域也表現出了巨大的市場潛力。單就產前診斷這一應用領域的市場，據估算就在150 億元左右。2013 年華大基因、貝瑞合康在無創產前篩查領域分別測序 10 萬人次和 5 萬人次，占據了大部分市場份額。除此之外，安諾優達、銳博生物、達安基因等依托測序技術的企業，共同分享著中國巨大的基因診斷市場。另外，美吉生物、諾禾致源則利用國外的測序系統，依托各自的生物信息分析能力，為更大范圍的科研、臨床醫學［10］、衛生檢疫、農業等領域提供測序、生物信息分析等服務［4］。

4.3 挑戰和機遇

盡管就現有的測序技術發展現狀來看，我國的測序技術研發相對落后、行業規模較小、技術力量薄弱，關鍵技術均被國外申請人牢牢把握、占領，但是，這并不意味著我國的測序技術沒有發展空間。高通量測序技術不僅涉及生物學一個科學領域，還涉及納米加工技術、微體積溶液控制、高速分子化學反應、高通量成像、計算軟件、數據壓縮、數據處理等多個領域的最新技術［11-12］。因此，在更快、更準、更廉價的技術發展要求下，我國的科研機構和企業大可以放開手腳、另辟蹊徑，從以上多領域入手，多維度改進現有基因測序技術和基因測序平臺，并積極申請專利，掌握自主的核心知識產權。在下游應用方面，提高數據處理能力、積極開發數據處理軟件及基因診斷產品將成為科研機構和企業的主攻方向，對測序結果的精確解讀將會帶來更多更廣的收益。因此，在測序技術下游，如科研服務、臨床診斷、衛生防疫、健康保險、司法鑒定、食品安全、生物能源等多個領域占領市場也不失為一個明智的選擇。

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10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2015.03.015

100190 北京，國家知識產權局專利局專利審查協作北京中心醫藥生物部生物工程一室

毛舒燕，Email：maoshuyan@sipo.gov.cn

2015-02-03

*同為第一作者