不同寄主來源的葡萄霜霉病菌致病力測定及孢子囊大小比較

黃曉慶, 孔祥久, 孔繁芳, 劉薇薇,王玉倩, 王忠躍, 張 昊

(中國農業科學院植物保護研究所,植物病蟲害生物學國家重點實驗室, 北京 100193)

?

不同寄主來源的葡萄霜霉病菌致病力測定及孢子囊大小比較

黃曉慶, 孔祥久, 孔繁芳, 劉薇薇,王玉倩, 王忠躍*, 張 昊*

(中國農業科學院植物保護研究所,植物病蟲害生物學國家重點實驗室, 北京 100193)

對采自我國不同地區、不同主栽葡萄品種‘紅地球’、‘巨峰’及‘赤霞珠’上的12份葡萄霜霉病菌的致病力及孢子囊大小進行了比較和分析,結果表明：采自不同葡萄品種的病原菌對感病葡萄品種‘奧迪亞無核’葉片的致病力具有明顯差異,其中‘巨峰’及‘紅地球’來源的病原菌致病性較強,明顯大于‘赤霞珠’來源的病原菌致病力;采自不同葡萄品種的霜霉病菌孢子囊大小存在一定的差異,‘赤霞珠’來源的病原菌孢子囊明顯大于‘巨峰’及‘紅地球’來源的霜霉病菌孢子囊。上述結果表明,采自不同寄主的葡萄霜霉病菌的致病力及孢子囊大小均存在一定程度的分化。

葡萄霜霉病菌; 致病力; 孢子囊大小

葡萄(Vitisspp.)是世界上栽培歷史最悠久的植物之一,葡萄鮮果及其產品具有多種價值,隨著人民生活水平的提高,對無公害葡萄及其產品的需求也逐漸增加,葡萄產業向著健康、優質、綠色的方向發展是大勢所趨。由葡萄霜霉病菌[Plasmoparaviticola(BerketCurtis) Berl.etde Toni](卵菌門,卵菌綱,霜霉目,霜霉科,單軸霉屬)引起的葡萄霜霉病是危害葡萄最嚴重的病害之一,目前,世界上幾乎所有的葡萄產區都有葡萄霜霉病的發生。一般年份,葡萄霜霉病引起的損失在5%左右,流行年份,可達20%～80%,嚴重制約了世界及我國葡萄產業的健康發展[1]。

葡萄霜霉病菌可以侵染葡萄的任何綠色幼嫩組織,主要危害葉片,造成葉片病斑,致使葉片早衰、脫落,從而使與葉片光合作用有關的所有生理過程受阻,若防治不及時,對整個植株的長勢、產量及品質都會造成嚴重的影響[2]。

國外的相關研究表明,采自不同寄主的葡萄霜霉病菌表現出明顯的寄主專化性,并且不同來源的霜霉病菌的孢子囊形態具有明顯的差異[3]。2013年,劉旭等對采自不同地區‘紅地球’的霜霉病菌菌株的生物學特性和致病力進行了比較,發現來自同一寄主不同地區菌株的孢子囊形態及致病力差異較小[4],而不同品種來源的葡萄霜霉病菌的致病力及孢子囊形態是否存在差異,與相應的寄主之間是否存在一定的相關性,目前尚不清楚。上述問題對于霜霉病菌群體的遺傳多樣性、預測預報及綜合防治問題至關重要,因此,筆者對采自不同寄主的霜霉病菌的致病力以及孢子囊形態進行了分析和比較。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株

供試菌株分別采自‘巨峰’(V.labrusca×V.vinifera‘Kyoho’)、‘紅地球’(V.vinifera‘ Red Globe’)、‘赤霞珠’(V.vinifera‘Cabernet Sauvignon’)3個葡萄品種,具體的信息見表1。

表1 供試葡萄霜霉病菌菌株來源

1.1.2 接種材料

接種材料為栽于中國農業科學院植物保護研究所溫室的‘奧迪亞無核’(V.vinifera‘Otilia’)扦插苗。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌的采集與培養

采集的病樣要求盡可能新鮮、純凈、無雜菌,并且未施用殺菌劑。采集的病葉先用蒸餾水沖洗2～3次,然后置于底部鋪有2層濕潤濾紙的培養皿內,25 ℃,L∥D=16 h∥8 h保濕培養,待病葉上長出新的濃密菌層,備用。

1.2.2 接種材料的培養

先將老熟的葡萄枝條用水浸泡24 h,使其吸收充足的水分,然后將枝條剪成小段(2～3芽/段),將剪短的葡萄枝條依次置于75%的乙醇1 min,5%的次氯酸鈉20 min進行表面消毒,然后立即用無菌水漂洗3次,最后將消毒過的枝條的下端置于0.005 g/mL的生根粉中浸泡,以促進枝條的萌發。然后將沙土、蛭石(1∶3)的混合物置于121 ℃濕熱滅菌30 min;將用生根粉處理過的枝條,扦插于滅菌土中,置于溫室的光照培養架上(溫度25 ℃,相對濕度65%,L∥D=16 h∥8 h)培養。

1.2.3 致病力測定

致病力試驗采用圓葉盤接種法。將采自不同寄主上的霜霉病菌接種到歐亞感病品種‘奧迪亞無核’上,觀察不同寄主來源的病原菌在同一感病材料上的致病力是否存在差異。具體的接種方法如下：

采集距葡萄苗頂端第5～6片葉作為接種材料,將收集的新鮮葉片用蒸餾水沖洗3次后于濾紙上晾干,之后使用直徑為11 mm的打孔器在無菌條件下將其打制成新鮮的葉盤,葉背朝上置于1%的水瓊脂培養基上備用;將來自不同寄主的霜霉病菌配制成含孢子囊1×105個/mL的懸浮液,每個葉盤上滴加20 μL,同時以滴加蒸餾水的葉盤作為陰性對照,每份樣品接種60個葉盤,(每皿20個,共3皿),將其置于光照培養箱(25 ℃)中黑暗培養24 h之后,用濾紙吸去多余的菌液繼續正常培養(25 ℃,L∥D=16 h∥8 h)。

于接種后3～9 d調查發病情況。記錄初始發病天數、9 d病葉數及發病級數。根據農業部農藥田間藥效試驗準則制定的分級標準[5],葡萄霜霉病病害嚴重度可分為6個級別：

0級：無病斑;

1級：發病面積占整個葉面積的6%以下;

3級：發病面積占整個葉面積的6%～10%;

5級：發病面積占整個葉面積的11%～20%;

7級：發病面積占整個葉面積的21%～50%;

9級：發病面積占整個葉面積的50%以上。

根據統計的結果,計算發病率及病情指數。

發病率(%)=發病葉盤數/調查總葉盤數×100；

病情指數=100×∑(各級病葉數×各級代表值)/(調查總葉數×最高級代表值)。

1.2.4 不同寄主霜霉病菌孢子囊大小的測定

在上述采集的新鮮病樣上直接挑取少量菌絲,配成孢子囊懸浮液,制成玻片置于10×40倍顯微鏡下測量其孢子囊大小,每個樣品隨機測量100個孢子囊的長和寬,并對其進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 致病力測定結果

不同寄主來源霜霉病菌接種于‘奧迪亞無核’的致病力結果(表2)表明,不同來源的霜霉病菌致使‘奧迪亞無核’發病的初始時間、9 d發病率及病情指數都有所不同,其中‘巨峰’來源的霜霉病菌在‘奧迪亞無核’上的潛育期最短,9 d發病率及病情指數都較高;而‘赤霞珠’來源的霜霉病菌潛育期較長,9 d發病率及病情指數相對較低。對其病情指數的統計分析結果表明,不同來源的霜霉病菌的致病力存在顯著差異(F=3.48,P<0.05),其中采自河北石家莊-2‘巨峰’上的菌株致病力顯著大于其他菌株,9 d病情指數高達55.56;采自河北昌黎-1‘赤霞珠’上的菌株致病力顯著低于其他菌株。

表2 不同葡萄品種來源的菌株致病力測定結果1)

1) 表中數據為平均數±標準誤;同列不同字母表示經Tukey’s HSD多重比較在0.05水平差異顯著。

Data are presented as mean±SE.Data with different letters in the same column are significantly different at 0.05 level.

將上述收集的菌株按照品種來源劃分為不同的群體,統計結果表明,不同群體之間的葡萄霜霉病菌的致病力存在顯著差異(F=4.37,P<0.05)(圖1～2)。其中，采自‘赤霞珠’的霜霉病菌的致病力顯著小于其他兩個品種,而‘巨峰’與‘紅地球’群體的霜霉病菌致病力差異不顯著;同一品種來源群體內來自不同地區的霜霉病菌菌株之間的致病力沒有明顯的差異,例如同是采自‘巨峰’葡萄的遼寧北寧菌株與河北石家莊1號和3號菌株之間的致病力無顯著差異;同是采自‘紅地球’葡萄的新疆地區與遼寧地區的霜霉病菌菌株之間的致病力也沒有顯著差異。說明不同品種來源的霜霉病菌致病力存在著一定程度的分化。

圖1 不同品種來源的霜霉病菌的致病力比較Fig.1 Pathogenicity analysis of isolates from different varieties

圖2 不同寄主來源的葡萄霜霉病菌接種結果Fig.2 P.viticola isolates from different grape varieties inoculated on V.vinifera ‘Otilia’

2.2 不同來源霜霉病菌孢子囊大小

對不同來源的葡萄霜霉病菌孢子囊大小進行測量，結果(表3)表明,不同來源葡萄霜霉病菌的孢子囊大小存在顯著差異(F=36.18,P<0.05),其中最大的孢子囊長度可達39.69 μm,最小的孢子囊長度為12.16 μm,最大的孢子囊寬度可達23.07 μm,最小的孢子囊寬度為9.13 μm。

表3 不同來源葡萄霜霉病菌的孢子囊大小1)

1) 表中數據為平均數±標準誤;同列不同字母表示經Tukey’s HSD多重比較在0.05水平差異顯著。

Data are presented as mean±SE.Different letters in the same column indicate significant difference at 0.05 level.

為進一步明確孢子囊大小的變化規律,將上述菌株按品種來源分為不同的群體,進行群體內及群體間孢子囊大小的比較。不同品種來源的霜霉病菌群體間的孢子囊長度(F=64.89,P<0.05)和寬度(F=111.90,P<0.05)均存在顯著差異(圖3),其中‘赤霞珠’來源的病原菌孢子囊長和寬顯著大于其他品種,‘紅地球’、‘巨峰’來源的病原菌孢子囊長和寬無顯著差異;而采自同一品種不論是同一地區來源還是不同地區來源的霜霉病菌的孢子囊大小都存在顯著差異(圖4),因此病原菌的孢子囊大小與相應的采集地區之間目前沒有發現明顯的相關性。但是不同品種來源的霜霉病菌孢子囊大小確實存在一定程度的分化。

圖3 不同品種來源的葡萄霜霉病菌群體孢子囊大小Fig.3 Sporangia size of P.viticola isolates from different grape varieties

圖4 同一寄主來源的葡萄霜霉病菌群體內孢子囊大小的比較Fig.4 Sporangia size of P.viticola isolates from the same grape variety

3 討論

葡萄霜霉病菌作為一種活體營養寄生菌,其室內接種方法主要有以下幾種：離體葉片接種、新鮮葡萄枝條接種、圓葉盤接種以及試管苗接種等,其中圓葉盤接種方法因其節省空間,節約接種材料,并且與田間反應最為接近,而得到廣泛的認可和應用[6-11]。

本研究通過葉盤接種試驗對霜霉病菌的致病力進行測定,結果顯示不同菌株對同一接種材料的致病性不同,并且不同品種來源的霜霉病菌群體之間的致病力差異顯著,來自歐美雜交種‘巨峰’、歐亞種‘紅地球’的病原菌致病力相近,其顯著大于‘赤霞珠’來源的菌株。說明不同品種來源的菌株致病力存在著一定程度的分化。由于目前葡萄霜霉病菌的致病力測定還沒有一套標準、有效、統一的寄主,因此在不同的研究中采用的致病力測定寄主可能有所不同。歐亞種‘奧迪亞無核’因其高度感染霜霉病菌的特性,而被作為本試驗的接種材料。但葡萄霜霉病菌作為一種專性寄生菌,活菌的保存和擴繁都有一定的難度,因此很難在短時間內同時獲得大量新鮮的采自不同寄主的病原菌,這在一定程度上限制了本研究對其致病力的進一步測定及驗證。

對不同來源的霜霉病菌孢子囊形態進行觀察,發現不同品種上霜霉病菌的孢子囊大小具有明顯差異,來源于‘赤霞珠’的霜霉菌的孢子囊顯著大于其他品種,而來源于‘紅地球’及‘巨峰’的病原菌孢子囊差異不大。同一品種不同地區來源的霜霉病菌孢子囊大小也存在顯著差異,說明不同來源的霜霉菌在孢子囊形態上確實存在著一定程度的分化。這與Savulescu、Golovina及Kump對孢子囊形態的觀察結果一致[12],但本試驗對于同一品種不同地區之間病原菌孢子囊大小的比較結果與劉旭的結果有所不同,這可能與這些因素更易受環境條件的影響有關,尚需要進一步的試驗驗證。

2013年,Rouxel通過交互接種試驗證實了不同來源的霜霉病菌對不同葡萄品種的致病力不同,并結合孢子囊形態的比較及系統發育分析方法,發現采自美洲的霜霉病菌是一個復合群體,其可能由4種不同的專化型組成[3],目前中國沒有相關報道。病原菌致病力測定及孢子囊形態的比較對其群體遺傳結構的研究具有重要意義,本試驗針對我國主栽葡萄品種上的葡萄霜霉病菌的致病力及孢子囊形態的分化進行了初步探索,但對于霜霉病菌群體學的研究,仍需進一步結合分子生物學手段進行相關試驗。

[1] 王忠躍.中國葡萄病蟲害與綜合防控技術[M].北京：中國農業出版社,2009.

[2] 劉世秋,郭銳,張軍翔.寧夏賀蘭山東麓葡萄灰霉病的發生與綜合防治[J].中外葡萄與葡萄酒,2012(4):38-40.

[3] Rouxel M, Mestre P, Comont G, et al. Phylogenetic and experimental evidence for host-specialized cryptic species in a biotrophicoomycete [J].New Phytologist, 2013, 197(1):251-263.[4] 劉旭, 梁曼, 王陽, 等. 不同地區葡萄霜霉病菌生物學特性及致病力研究[J].北方園藝, 2013 (6):119-122.

[5] 農業部農藥檢定所. 農藥田間藥效試驗準則[S].北京：中國標準出版社,2000.

[6] Liu S M, Sykes S R, Clingeleffer P R.A method using leafed single-node cuttings to evaluate downy mildew resistance in grapevine [J].Vitis-Geilweilerhof, 2003, 42(4):173-180.

[7] Liu S M, Sykes S R, Clingeleffer P R.Variation between and within grapevine families in reaction to leaf inoculation with downy mildew sporangia under controlled conditions [J].Vitis-Geilweilerhof, 2008, 47(1):55.

[8] Brown M V, Moore J N, Fenn P, et al. Comparison of leaf disk, greenhouse, and field screening procedures for evaluation of grape seedlings for downy mildew resistance[J].HortScience, 1999, 34(2):331-333.

[9] Boso Alonso S, Kassemeyer H H.Different susceptibility of European grapevine cultivars for downy mildew [J].Vitis, 2008, 47(1):39-49.

[10]Sotolar R.Comparison of grape seedlings population against downy mildew by using different provocation methods [J].Notulae Botanicae Horti Agrobotanici Cluj-Napoca, 2007, 35: 61-68.

[11]Staudt G, Kassemeyer H H.Evaluation of downy mildew resistance in various accessions of wildVitisspecies[J].Vitis, 1995, 34(4):225-228.

[12]Gessler C, Pertot I, Perazzolli M.Plasmoparaviticola: a review of knowledge on downy mildew of grapevine and effective disease management [J].Phytopathologia Mediterranea,2011,50(1):3-44.

(責任編輯：王 音)

Pathogenicity and sporangia size analysis ofPlasmoparaviticolafrom different grape varieties

Huang Xiaoqing, Kong Xiangjiu, Kong Fanfang, Liu Weiwei, Wang Yuqian, Wang Zhongyue, Zhang Hao

(State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China)

Twelve samples from different planting areas were collected on ‘Kyoho’, ‘Red Globe’ and ‘Cabernet Sauvignon’, which were mainly grape varieties in China. The pathogenicity was tested and the size of sporangia was measured. The results showed that the ability ofPlasmoparaviticolaisolates from different grape varieties to colonizeVitisvinifera‘Otilia’ leaf tissue differed significantly. Isolates from ‘Kyoho’ and ‘Red Globe’ were significantly more aggressive than those from ‘Cabernet Sauvignon’. And sporangia size from different grape varieties differed significantly too. Isolates from ‘Cabernet Sauvignon’ were significantly bigger than others. In conclusion, there were significant differences in aggressiveness and sporangia size among isolates from different hosts.

Plasmoparaviticola; pathogenicity; sporangia size

2014-04-21

2014-07-31

公益性行業(農業)科研專項(201203035)；國家現代農業產業技術體系專項資金(nycytx-30)

S 436.631.1

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.03.035

致 謝： 感謝國家葡萄產業體系各綜合試驗站為本研究提供的葡萄霜霉病樣品。

* 通信作者 E-mail:wangzhy0301@sina.com; hzhang@ippcaas.cn