重慶地區辣椒疫霉菌的分離培養及生理小種鑒定

張世才, 熊 艷, 黃任中, 李怡斐, 呂中華, 黃啟中

(重慶市農業科學院蔬菜花卉研究所, 重慶 401329)

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重慶地區辣椒疫霉菌的分離培養及生理小種鑒定

張世才, 熊 艷, 黃任中, 李怡斐, 呂中華, 黃啟中*

(重慶市農業科學院蔬菜花卉研究所, 重慶 401329)

本試驗分離鑒定了來源于重慶不同辣椒產區的14個病原菌分離物, 經形態特征鑒定及回接發病特征觀察,確定這些菌株均為辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)。14個菌株在OMA培養基上誘導產生的孢子囊形態類似,形狀多為卵圓形或長橢圓形,乳突明顯。對PDA、OMA、CA及V8汁4種培養基上的培養性狀觀察表明,辣椒疫霉菌株在OMA培養基上生長速度最快,但在V8汁培養基上產孢最多。采用灌根法對14個菌株進行生理小種鑒別,其中10個為race 3,2個為race 2,2個為race 1,初步推定race 3為重慶地區辣椒疫病病原菌的優勢小種。

重慶; 辣椒疫霉; 培養性狀; 生理小種

由辣椒疫霉菌(Phytophthoracapsici)侵染引起的辣椒疫病是辣椒生產上的重要病害[1]。迄今,在我國廣東、陜西和四川等多個地區辣椒種植區均有辣椒疫病大面積發生的報道,重慶作為我國辣椒主產區之一,近年來隨著種植規模的不斷擴大以及常年連作種植,該病害逐年加重,嚴重制約著辣椒生產。研究表明,不同辣椒疫霉菌菌株不但致病力存在顯著差異,還存在生理小種分化的情況,且不同地區優勢生理小種也可能存在差異[2-4]。為了明確重慶地區辣椒疫霉菌生理小種構成及其分布,本研究對采自11個辣椒產區的14個分離物在不同培養基上的培養性狀進行觀察,并通過接種鑒別寄主明確了這14個分離物的生理小種類型,以期對辣椒疫病的防治及抗病品種的分布與選育提供可靠的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

辣椒病樣于2011-2013年采自重慶潼南、銅梁、永川、江津、合川、北碚、巴南、石柱等辣椒主產區。經分離、純化獲得14株辣椒疫霉菌菌株,菌株來源及編號見表1。

表1 病原菌的采集地點、辣椒品種及采樣組織

1.2 病原菌分離與保存

疫霉菌分離參照鄭小波[5]的方法,從重慶辣椒主產區發病田塊采集具有辣椒疫病典型癥狀的病莖或病果,用自來水將組織表面沖洗干凈,然后切取病健交界處組織2～3小塊,置于選擇性燕麥培養基(OMA)平板上(含青霉素50 mg /L、五氯硝基苯50 mg/L、利福平100 mg/L),25～28 ℃培養2 d后,挑取菌落邊緣菌絲少許,轉接到不含藥劑的OMA培養基上,在25～28 ℃培養3 d,之后從菌落邊緣挑取菌絲少許,在OMA培養基上培養,進行菌株純化。從純化的菌株菌落邊緣切取病原物菌塊,回接到辣椒植株莖部,28 ℃下棉花保濕培養,選取表現與田間癥狀相同的分離物進行菌株鑒定。純化后的菌株轉接入V8汁培養基試管斜面,于28 ℃下培養5～7 d,待菌絲長滿斜面,于16 ℃環境中保存。

1.3 病原菌鑒定

將純化的菌株接種到OMA培養基上，于28 ℃培養3 d后,切取菌落邊緣菌絲塊移至OMA平板中央,在28 ℃黑暗恒溫下培養7 d后,觀察病原菌的菌落形態、菌絲以及孢子囊的形態特征。

1.4 不同培養基上培養性狀觀察

選擇疫霉菌分離培養常用的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)、胡蘿卜培養基(CA)、V8汁培養基及燕麥培養基(OMA)4種,測定不同培養基對菌株菌落生長速度及產孢的影響。選取TNB為供試菌株,TNB在上述4種培養基上生長3 d后,用打孔器(內徑4 mm)沿菌落邊緣打取菌絲塊,移至4種培養基平板中央,每皿1塊,分別轉接3皿,重復3次。培養皿直徑為9 cm,每皿倒14 mL培養基。接種后將培養皿置于28 ℃黑暗培養。5 d后觀察供試菌株在不同培養基上的菌落形態、菌絲密度,并測量菌落直徑。供試菌株繼續黑暗培養14 d后,顯微鏡觀察孢子囊數量。

1.5 生理小種的測定

1.5.1 鑒別寄主

鑒別寄主由世界蔬菜研究中心提供,分別為‘Early calwonder’、‘PBC137’、‘PBC602’和‘PI201234’。其中‘Early calwonder’不帶抗病基因,其他3個分別含有不同的抗病基因(表2),其組合可用于鑒別辣椒疫霉生理小種race 1、race 2及race 3。

表2 辣椒疫霉生理小種的判定1)

1) S為感病；R為抗病。

S means susceptible; R means resistant.

1.5.2 病原菌的培養

病原菌的培養方法參照文獻[6],略有改動。將分離保存的14個待測菌株分別在V8汁培養基上于28 ℃下培養7 d,再將其置于熒光燈下照射48 h以誘發其產生孢子囊。待產生大量孢子囊后加入適量無菌水,用刀片刮動平板培養基表面收集菌絲和孢子囊。收集的病原菌培養物用兩層紗布過濾后將孢子懸浮液置于4 ℃下30 min,然后置于室溫下3 h以促進游動孢子的形成和釋放。

1.5.3 鑒別寄主的培育

鑒別寄主的種子首先用10%的次氯酸鈉溶液浸泡5～10 min,然后用清水沖洗干凈,置于28 ℃恒溫培養箱中催芽。待種子發芽后播于裝有育苗基質的60孔育苗穴盤內。育苗基質成分為草炭和蛭石(2∶1)。基質經高溫蒸汽滅菌(121 ℃,30 min)。待出苗后,幼苗置于25 ℃日光溫室內培養,常規肥水管理。

1.5.4 接種

當鑒別寄主幼苗長至6～7葉時進行孢子懸浮液灌根接種,每個待測菌株分別接種1套鑒別寄主,3次重復,每個鑒別寄主接種30株,接種游動孢子濃度1×103個/mL。接種前澆透水,用移液器吸取3 mL孢子懸浮液注入鑒別寄主根部附近基質,接種后將植株置于25 ℃溫室內,每天光照10～12 h,接種后適時澆水,使基質濕度保持近飽和狀態。

1.5.5 病害調查及小種鑒定

接種7 d后調查幼苗莖基部發病情況,確定待測菌株的生理小種類型。鑒別寄主的感抗類型：發病率>20%為感病型,發病率≤20%為抗病型[4]。

2 結果與分析

2.1 田間病害調查

對重慶地區辣椒疫病的田間調查結果表明,辣椒疫病在各區縣均有發生,且在不同地區,不同品種上病情存在差異。病害發生期主要為5-7月,適宜溫度25～30 ℃,植株受侵染后,病部呈水漬狀,后迅速變褐,病部明顯縊縮,造成地上部折倒。果實染病始于蒂部,初生暗綠色水漬狀斑,隨后變褐軟腐,濕度較大時表面長出白色霉層,即為病原菌孢囊梗及孢子囊(圖1)。

圖1 辣椒疫霉侵染植株的典型癥狀Fig.1 The typical symptoms of pepper infected by P.capsici

2.2 辣椒疫霉形態特征

以田間采集的辣椒樣品為材料,共分離純化得到14個菌株,這14個菌株在OMA上生長速度較快,氣生菌絲中等、菌絲無隔膜,孢囊梗分枝不規則,

成熟的孢子囊具長柄,易脫落。孢子囊形狀以橢圓形和長橢圓形為主,乳突明顯,孢子囊在水中能釋放出游動孢子,游動孢子腎形,帶有鞭毛(圖2),初步確定其均為辣椒疫霉。

圖2 辣椒疫霉孢子囊的產生及游動孢子的釋放Fig.2 Sporangia and zoospores of P.capsici

2.3 辣椒疫霉在不同培養基上的培養性狀

本試驗所分離的菌株TNB在4種培養基上的培養特性(表3、圖3)明顯不同。在OMA平板上的菌落呈絨毛狀,氣生菌絲很多,菌絲較疏松、色白、生長很快;在CA和PDA上的菌落為棉絮狀,氣生菌絲較多,菌絲濃密、較厚、生長較慢;而在V8汁平板上呈放射狀生長,菌落扁平、菌絲較薄,色較淺,菌絲生長速度較快。產孢方面則表現為在V8汁培養基上孢子囊數量最多,OMA次之。可見,菌株的菌落形態、生長速度及菌絲疏密程度與孢子囊數量之間沒有明顯的相關性。

表3 辣椒疫霉在不同培養基上的培養性狀1)

1) “+”表示孢子囊數量較少;“++”表示孢子囊數量中等;“+++”表示孢子囊數量較多；“++++”表示孢子囊數量很多。數據后不同小寫字母表示生長速率間在0.05水平差異顯著。

“+”means a small number of sporangium； “++” means a moderate number of sporangium； “+++” means a larger number of sporangium； “++++” means the largest number of sporangium. Data with different small letters are significantly different at 0.05 level.

圖3 辣椒疫霉在不同培養基上的培養性狀Fig.3 The culture characters of P.capsici isolates on different media

2.4 辣椒疫霉生理小種鑒定

按照世界蔬菜研究中心提供的鑒別寄主,采用李智軍[4]的方法對重慶地區14個辣椒疫霉菌菌株進行了生理小種鑒定,結果表明,BB和SZ菌株屬于race 1,TNZ、TNB菌株屬于race 2,而DX、YD、YC、JJ、RC、HC、TL、TNY、TNG及HT菌株屬于race 3(表4)。race 3所占比例最大,為71%。

表4 不同地區的辣椒疫霉菌生理小種確定1)

1) 括號內數據為接種后第7天的發病率(%)。S：感病;R：抗病。

Data in the parenthesis are disease incidence (%) at 7th day after inoculation. S means susceptible；R means resistant.

3 討論

本研究對來源于重慶11個辣椒產區的14個辣椒疫霉分離物進行了鑒定,經菌絲及孢子囊形態特征觀察,參照鄭小波等[5]對辣椒疫霉菌的描述,確定這14個菌株均為辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)。

關于辣椒疫霉菌在不同培養基上的菌落形態、孢子囊的產生等生物學性狀前人已有報道,徐作珽等[7]發現辣椒疫霉在玉米面和燕麥片培養基上生長最佳;戚仁德等[8]認為辣椒疫霉菌株在不同培養基上的培養性狀存在差異,HX-1菌株在OMA培養基上生長最快,產生孢子囊數量最多,比較適合生長。本研究結果表明辣椒疫霉菌同一菌株在不同培養基上的培養性狀存在明顯差異,具體表現為TNB菌株在OMA培養基上生長最快,但在V8汁培養基上產孢最多,菌株的菌落形態、生長速度與孢子囊數量無關。另外還發現采自不同地區的辣椒疫霉菌株在同一培養基上的培養性狀也有所不同,這與前人的研究結果相吻合。

本研究利用一套鑒別寄主,采用灌根法對重慶地區14株辣椒疫霉菌進行了生理小種鑒定,發現有10株屬于race 3,2株屬于race 1,2株屬于race 2,由此推測race 3為重慶地區的優勢小種。李智軍等[4]的研究結果表明,race 3為廣東地區優勢生理小種,羅德旭等[9]研究表明,安徽淮安地區分離得到的3份辣椒疫霉菌均屬于race 1,而馬輝剛等[10]研究發現危害江西辣椒的疫霉病原菌生理小種以race 2占優勢,由此可見辣椒疫霉生理小種在我國的分布存在差異,對辣椒疫霉優勢生理小種在全國的具體分布情況,還需擴大采樣范圍進一步確認。此外,不同的地區其主栽品種存在差異,因此在選育適合重慶地區的辣椒抗疫病品種時,應采用race 3進行抗病性鑒定和抗源篩選,才能獲得有效的抗病性材料或品種。

[1] 楊學輝,肖崇剛,袁潔.貴州辣椒疫病病原鑒定及生物學特性研究[J].西南農業大學學報(自然科學版),2004,26(4):413-416.

[2] 李萍,江濤,高智謀,等.辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)對辣椒的致病力分化研究[J].植物病理學報,2012,42(4):431-435.

[3] 羅德旭.辣椒疫霉菌生理小種及其抗性研究[D].楊凌：西北農林科技大學,2008.

[4] 李智軍,龍衛平,鄭錦榮,等.廣東辣椒疫霉菌分離鑒定及其致病力和生理小種分化研究[J].華南農業大學學報,2007,28(1):50-54.

[5] 鄭小波.疫霉菌及其研究技術[M].北京：中國農業出版社,1997:10-132.

[6] NY/T 2060.1-2011.中華人民共和國農業行業標準.辣椒抗病性鑒定技術規程 第1部分：辣椒抗疫病鑒定技術規程[S].北京：中國農業出版社,2011.

[7] 徐作珽,李林,魏道君,等.大棚辣椒疫病菌的分離培養及藥劑防治[J].植物保護,1999,25(2):29-31.

[8] 戚仁德,丁建成,顧江濤,等.不同培養基對辣椒疫霉致病力的影響[J].安徽農業科學,2001,29(1):96-97.

[9] 羅德旭,孫玉東,楊紅,等.淮安地區辣椒疫霉菌生理小種鑒定[J].江西農業學報,2013,25(1):85-86.

[10]馬輝剛,何烈干,張海良,等.江西省辣椒疫霉生理小種構成及其對烯酰嗎啉的敏感性分析[J].植物保護學報,2013,40(4):374-378.

(責任編輯：楊明麗)

Isolation and cultivation ofPhytophthoracapsiciand identification of physiological race in Chongqing

Zhang Shicai, Xiong Yan, Huang Renzhong, Li Yifei, Lü Zhonghua, Huang Qizhong

(Vegetable and Flower Research Institute of Chongqing Academy of Agricultural Sciences,Chongqing 401329, China)

Fourteen isolates collected from different pepper-cultivating regions in Chongqing were determined. Based on their morphological characteristics and symptoms after re-inoculated to pepper, these Isolates were identified asPhytophthoracapsiciLeonian. The sporangia of the fourteen isolates induced on OMA medium were morphologically similar, and most of them were ovate or elliptic, with obvious papillate. There were evident differences in mycelial growth rate, productivity of sporangia on different medium. On the OMA medium, the mycelia grew fastest, while the largest number sporangium are produced on the V8 medium. Physiological race identification test showed that ten isolate belonged to race 3, two isolates belonged to race 1, and two isolate belonged to race 2. Race 3 is probably the dominant race in Chongqing.

Chongqing;Phytophthoracapsici; culture characters; physiological race

2014-03-19

2014-08-06

重慶市科技攻關重點項目(cstc2012ggC80005)；重慶市科技攻關計劃項目(cstc2011ggBo104);重慶市農業科技成果轉化資金項目(cstc2014jcsf-nycgzhA80026)

S 436.418.1

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.03.036

* 通信作者 E-mail: 598261580@qq.com