我國北方部分蘋果主產區病毒病的發生與檢測

郝 璐, 葉 婷, 陳善義, 王少杰, 周 穎,范在豐, 國立耘, 周 濤

(中國農業大學植物病理學系， 北京 100193)

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我國北方部分蘋果主產區病毒病的發生與檢測

郝 璐, 葉 婷, 陳善義, 王少杰, 周 穎,范在豐, 國立耘, 周 濤*

(中國農業大學植物病理學系， 北京 100193)

蘋果病毒病在我國廣泛發生，已成為限制我國蘋果優質高產的關鍵因素。20世紀80年代曾對其做過詳細的調查和研究，但近年來由于各地農業產業結構調整等因素，蘋果病毒病的發生特點有了不同程度的變化。為了解目前我國蘋果病毒病的發生情況，在我國北方蘋果主產區山東、陜西、山西、遼寧、北京和黑龍江6個省市的部分地區采集蘋果樣品共計267份，經RT-PCR檢測和擴增產物的克隆與測序分析表明在上述地區采集的樣品中，蘋果褪綠葉斑病毒(ACLSV)、蘋果莖溝病毒(ASGV)、蘋果莖痘病毒(ASPV)、蘋果銹果類病毒(ASSVd)的發生率分別為66.7%～100.0%、38.1%～94.1%、4.8%～85.7%和4.8%～48.6%；蘋果凹果類病毒(ADFVd)僅在山東的兩個果園零星發生；6個省市樣品中病毒復合侵染率分別為67.1%、92.1%、75.0%、88.2%、94.1%和76.2%。

蘋果病毒病; 潛隱病毒; 類病毒; 分子檢測

蘋果是我國第一大水果，在農民增收致富、推進農業結構調整以及出口創匯等方面起著舉足輕重的作用。蘋果受病毒侵染后，終生帶毒，病毒在樹體內增殖,干擾、破壞樹體的正常生理機能，導致長勢減退、產量下降、品質變劣、不耐貯藏[1-2]。目前，已在我國發現并鑒定的有蘋果花葉病毒(Applemosaicvirus, ApMV)、蘋果褪綠葉斑病毒(Applechloroticleafspotvirus, ACLSV)、蘋果莖溝病毒(Applestemgroovingvirus, ASGV)、蘋果莖痘病毒(Applestempittingvirus, ASPV)、蘋果銹果類病毒(Applescarskinviroid, ASSVd)以及蘋果凹果類病毒(Appledimplefruitviroid, ADFVd)[3-4]。其中，ACLSV、ASGV和ASPV侵染后不表現明顯的癥狀，被稱為潛隱性病毒。

蘋果病毒病為系統性侵染病害，主要通過嫁接、自然根接與機械接種傳播，目前為止沒有發現任何昆蟲傳毒介體[3]。病毒可以對蘋果樹的生長產生多方面的影響，除了引起樹體生長減弱、葉片變小和果實畸形外，還可導致樹體急劇衰退、提早枯死或采前落果，甚至絕產。此外，病毒還影響蘋果苗木質量，引起砧穗不親和、苗木根系發育不良以及果實風味變劣，品質下降。與此同時，病毒對蘋果根系對土壤營養物質的吸收和利用也產生影響[5]。對蘋果產業危害最大的是類病毒，如ASSVd和ADFVd侵染蘋果樹，在葉片和枝條上均不引起明顯癥狀，但導致果實發生銹果、花臉、果面凹凸不平、果實變小畸形等癥狀，嚴重降低蘋果經濟價值甚至導致絕收。

我國在20 世紀80 年代初，將果樹病毒病研究列為國家重點科技攻關項目，許多學者相繼對蘋果病毒病做了詳細的調查和研究[1,6-8]。近年來，由于各地農業產業結構調整，蘋果品種不斷更新，栽培面積迅速增長，栽培管理技術及病蟲害防治方法不斷改進和苗木市場日益混亂等因素，蘋果主要病毒病害的結構和發生特點有了不同程度的變化。為了解目前我國蘋果病毒病的發生情況，同時為優質苗木繁育、優質果品生產提供依據，2008年至2013年，我們先后從山東、陜西、山西、遼寧、北京和黑龍江6個省市采集總計267個樣品，對其進行了3種潛隱病毒以及2種類病毒的檢測。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2008年至2013年，在山東、陜西、山西、遼寧、北京和黑龍江6個省市主產區果園隨機采集蘋果枝條、葉片與果實，共267個樣品(具體采集地點及數量見表1)，裝入自封袋整理后保存在4 ℃冰箱中。

1.2 植物總RNA提取

取0.2 g樣品(枝條、葉片或果實)，按Easy Spin 植物RNA快速提取試劑盒(購自北京博邁德生物公司)說明書提取蘋果樣品總RNA，于-20 ℃保存備用。

表1 樣品采集地及數量信息

1.3 反轉錄反應

取蘋果樣品總RNA 3.5 μL、5×M-MLV Buffer 4.0 μL、10 μmol/L隨機引物1.0 μL、10 mmol/L dNTPs 1.0 μL、RNA酶抑制劑0.5 μL、200 U/μL M-MLV酶0.5 μL，加DEPC處理水至20 μL，42 ℃反應1 h，于-20 ℃保存備用。

1.4 PCR擴增、克隆與測序

檢測引物均為已發表引物(表2)，由華大基因科技股份有限公司合成。PCR反應體系為反轉錄產物cDNA 2.0 μL、10×Buffer 2.5 μL、dNTPs(10 mmol/L) 0.5 μL、正向引物(20 μmol/L)0.5 μL、反向引物(20 μmol/L)0.5 μL、TaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.25 μL，加ddH2O至25 μL。PCR反應條件為94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，對應引物適宜退火溫度(表2)復性45 s，72 ℃延伸1 min，35個循環；最后72 ℃延伸10 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳驗證后，按DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒(購自北京天根生化科技有限公司)說明書回收PCR產物，之后連接到pMD18-T克隆載體(購自大連寶生物公司)。陽性克隆經驗證后由華大基因科技股份有限公司測序，所得的序列與GenBank中已報道的序列進行比對分析。

表2 用于蘋果病毒病RT-PCR檢測的引物

續表2 Table 2(Continued)

引物名稱Nameofprimer序列(5′?3′)Sequence目標片段/bpTargetsegment退火溫度/℃Annealingtemperature參考文獻ReferenceASSVd?FCCGGTGAGAAAGGAGCTGCCAGCA27855郭瑞等[12]ASSVd?RCCTTCGCCTTCGTCGACGACGACAGGTGAGTADFVd?FGAGGAAAACTCCGTGTGGTTC27155Lietal．[13]ADFVd?RAAGTCCACTCCCTGCCAGACC

2 結果與分析

2.1 病毒的檢測

以提取的蘋果樣品總RNA為模板，利用表2中的引物分別進行檢測，結果表明PCR擴增后可以獲得與預期的目標片段大小相同的條帶(電泳圖未列出)。將這些條帶進行瓊脂糖凝膠回收純化，克隆到pMD18-T載體并進行序列測定，所得序列與GenBank中已報道的序列進行比對分析，結果證明擴增到的片段為目標片段。

2.2 病毒的發生與分布

將2008年至2013年的檢測結果統計分析，結果如圖1所示，可以看出我國北方蘋果主產區病毒病與類病毒病的發生非常普遍，采樣地區均不同程度地受到侵染。ACLSV在6個省市的發生率均高于60%，其中山西省的發生率甚至高達100%，已成為我國目前發生最為普遍的蘋果病毒。ASGV發生率也普遍較高，除黑龍江的發生率不到50%外，其余省市均高于60%。ASPV和ASSVd的發生率相對較低，但在不同省市間發生率差別較大，在新發展的蘋果產區—陜西省，這兩種病毒的發生率均高于其他省市。在山東的樣品中檢測到我國新發生的ADFVd，發生率非常低。在調查檢測的6個省市樣品中，一種以上病毒的復合侵染發生率均高于60%，其中陜西和北京的樣品復合侵染率高于90%。

圖1 我國北方6省市蘋果病毒與類病毒的發生情況直方圖Fig.1 Frequency histogram of the viruses and viroids infecting apples in six provinces of northern China

將不同地區主栽品種的病毒與類病毒的發生情況進行分析可以看出(表3)，病毒在不同品種蘋果上的發生率存在一定的差異。總體來說，‘富士’、‘王林’的病毒發生率要高于其他品種，且這兩個品種的樣品中有病毒和類病毒復合侵染的發生。同一品種在不同地區受侵染情況也有所不同，遼寧地區‘富士’蘋果上的病毒發生率要明顯低于其他地區。‘金紅’是黑龍江的主栽品種，能抵抗-30 ℃的低溫，由于其所處地理位置特殊，氣候寒冷，病毒的發生率較其他品種要低很多。

表3 不同地區蘋果主栽品種中病毒與類病毒的發生率

3 討論

蘋果病毒病為系統性侵染病害，主要經由嫁接等無性繁殖傳播，病毒在蘋果樹體內逐年積累和危害，目前沒有有效的藥劑，造成了病毒病危害日趨嚴重的現狀。準確掌握我國目前蘋果產區的病毒分布情況是有效防控病毒病的基礎，對繁育、推廣無毒苗木和果品優質高產具有重要的指導意義。經過對山東、陜西、山西、遼寧、北京和黑龍江6個省市部分蘋果產區樣品采集和室內檢測，發現我國北方蘋果主產區的病毒病害發生相當嚴重，ACLSV、ASGV、ASPV、ASSVd的平均侵染率為79.0%、72.5%、49.0%和23.2%。與20世紀80年代蘋果病毒病發生情況相比，3種潛隱病毒發生率依舊很高；危害性極強的類病毒發生率明顯上升，如ASSVd已成為一些地區蘋果減產的首要類病毒病害；發生了新的類病毒(ADFVd)。這些數據表明我國目前蘋果病毒病發生普遍，防控形勢嚴峻。雖然目前采集樣品的地點和數量有限，但這些數據基本反映了我國北方蘋果病毒病的發生情況，也為后續調查提供了參考。

在6個省市中，多種病毒的復合侵染率高，有些地區甚至超過了90.0%，主要原因可能是攜帶病毒的無性繁殖材料隨意嫁接，缺乏有效監管，使得一些沒有技術保障的育苗圃生產了大量攜帶多種病毒的苗木。同時，新的栽培模式的推廣(如蘋果矮化栽培模式)，進一步增加了復合侵染的風險。

鑒于目前同一病毒在不同地區的發生率差異較大，同一地區不同病毒的發生率差異也很大的情況，在種苗繁育、調運過程中要加強檢疫，尤其是對危害性極強的類病毒如ASSVd和ADFVd。在我國，ADFVd僅在新疆、山東零星分布[3]，必須采取措施防止其傳播和擴散。繁育栽培無毒苗和無毒化栽培管理是健康、高效生產蘋果的關鍵。我國必須加強蘋果病毒病的研究、檢測和防控等方面工作，建立高效的檢測方法、監測手段和相關章程，在加強檢疫的同時，要推廣無毒苗木的使用，建成政府主導，科研院所及相關企業參與，結合農戶生產實踐的自上而下的網絡模式，提高果樹病毒及類病毒病的源頭控制能力，有效防止主要果樹病毒病的大面積擴散，促進蘋果產業健康、快速的發展。

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Occurrence and detection of virus diseases in some major apple-producing regions in northern China

Hao Lu, Ye Ting, Chen Shanyi, Wang Shaojie, Zhou Ying, Fan Zaifeng, Guo Liyun, Zhou Tao

(Department of Plant Pathology, China Agricultural University, Beijing 100193, China)

In China, apple virus diseases spread wide and have become a key factor decreasing the quality and production of apple fruits. In the early 1980s, investigation on apple virus diseases was performed. However, the occurrence and characteristics of apple virus diseases have changed in recent years due to the adjustment of agricultural industrial structure. To determine the current status of apple virus diseases in China, we detected a total of 267 apple samples collected from major apple-producing regions in northern China, including Shandong, Shaanxi, Shanxi, Liaoning, Beijing, and Heilongjiang. RT-PCR, cloning and sequencing revealed that the infection rates of apple trees withApplechloroticleafspotvirus,Applestemgroovingvirus,ApplestempittingvirusandApplescarskinviroidwere 66.7%-100.0%, 38.1%-94.1%, 4.8%-85.7%, and 4.8%-48.6%, respectively.Appledimplefruitviroidwas only found in two orchards of Shandong Province. The multiple infection rates in the six provinces were 67.1%, 92.1%, 75.0%, 88.2%, 94.1%, and 76.2%, respectively.

apple virus disease; latent virus; viroid; molecular detection

2014-03-24

2014-06-25

現代蘋果產業技術體系(CARS-28)；公益性行業(農業)科研專項(201203076-02)

S432.1

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.02.030

* 通信作者 E-mail:taozhoucau@cau.edu.cn.