祛風通絡方對阿霉素大鼠腎小球內皮細胞 VEGF及其受體 FLK-1表達的影響

王 娟，崔志軍，馬巧亞，王 竹，孫萬森*

（1．西安交通大學醫學院第二附屬醫院，中國皮膚性病學雜志編輯部，西安710004；2．陜西省交通醫院急診科，西安710004）

祛風通絡方對阿霉素大鼠腎小球內皮細胞 VEGF及其受體 FLK-1表達的影響

王 娟1，崔志軍2，馬巧亞1，王 竹1，孫萬森1*

（1．西安交通大學醫學院第二附屬醫院，中國皮膚性病學雜志編輯部，西安710004；2．陜西省交通醫院急診科，西安710004）

目的 研究祛風通絡方對阿霉素模型大鼠腎小球內皮細胞VEGF及其受體FLK-1表達的影響。方法 130只SD大鼠抽出30只作為空白對照組（A組），余下大鼠采用阿霉素給予尾靜脈一次性注射構建大鼠腎病模型，造模成功后，隨機分為模型組（B組，n＝18）、祛風通絡方組（C組，n＝18），祛激組（祛風通絡方和激素共用組，D組，n＝18），激素組（E組，n＝18），苯那普利組（F組，n＝18），構建腎小球內皮細胞阿霉素模型，給予相應大鼠血清治療，鄰苯三酚紅／鉬酸鹽法檢測24 h尿蛋白定量；全自動生化分析儀檢測血清白蛋白（ALB）、血脂（TG）、腎功能BUN、Cr；Western Bloting及RT-PCR檢測腎小球內皮細胞VEGF及其受體FLK-1的表達。結果

祛風通絡方；VEGF；FLK-1；腎功能

慢性腎臟疾病（CKD）已成為世界范圍內亟需解決的健康問題［1］，其患病率在10%左右［2］。中醫藥治療CKD以“腎病從風論治”的理論有著獨特的優勢和特點，值得研究人員進一步探討與發掘。祛風通絡類方藥被諸多腎病臨床學者應用于慢性腎病的治療，取得了確切療效［3-4］。實驗室前期的研究［5-9］證實 ，祛風通絡方能夠降低腎小球腎炎大鼠血清IL-6、IL-8水平，保護腎功能；抑制腎組織α-SMA的表達，從而影響腎小球系膜細胞的重塑，并能延緩腎小球硬化的進展等。然而，祛風通絡方對腎小球內皮細胞受體信號傳導系統知之甚少，本研究將構建大鼠腎病模型并于腎小球內皮細胞相結合，研究祛風通絡方對VEGF及其受體FLK-1表達的影響。報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物、細胞、藥物與試劑 健康清潔級雄性SD大鼠130只，購于西安交通大學醫學院動物實驗中心（合格證號為陜醫動字第09-005號）；4周齡H-2KbtsA58轉基因小鼠購自CharleSRiver公司（USA）。祛風通絡方稀釋液（烏梢蛇15 g，黃芪30 g，青風藤20 g，桑寄生30 g，海風藤20 g，生地黃20 g）由西安交通大學第二附屬醫院中醫科制劑室提供；醋酸強的松片：西安利君制藥有限責任公司；阿霉素：浙江海正藥業；苯那普利：北京諾華制藥有限公司；血管內皮生長因子（VEGF）、VEGF受體（FLK-1）與β-actin-抗：Cell Signaling，USA；Trizol：Gibco，USA；RT-PCR試劑盒：MBI。

1.2 動物分組、模型制備與給藥 SD大鼠130只，適應性喂養1周后，隨機抽出30只為空白對照組（A組），余下100只按6 mg／kg給予尾靜脈一次性注射阿霉素（ADR），制成病理模型，A組給予等容量生理鹽水。3周后腎病模型造模成功，死亡10只。余下90只大鼠隨機分為5組，每組18只，即模型組（B組）、祛風通絡方治療組（C組），祛激組（祛風通絡方和激素共用組D組），強的松治療組（E組），苯那普利治療組（F組）。造模成功后，各組大鼠灌胃1次／d，另外給予自由飲食。A、B組給予2 mL蒸餾水；C組給予祛風通絡方藥液（含生藥2.1 g／mL）和蒸餾水各1 mL；D組給予強的松藥液（25 mg／kg）和祛風通絡方藥液各1 mL；E組給予強的松藥液和蒸餾水各1 mL；F組給予苯那普利（0.34 mg／kg）和蒸餾水各1 mL。

1.3 腎小球內皮細胞的培養、模型制備與給藥 A、B、C、D、E、F組給予相應藥物灌胃，1次／d。C、D、E、F 4組大鼠用藥14 d，于末次給藥4 h后，各組隨機抽取4只，斷頭取血，離心取血清，滅活并過濾后-70℃真空干燥成粉末，-20℃保存備用。分離H-2Kb-tsA58轉基因小鼠的腎小球內皮細胞 ，于 33℃、IFN-γ（20 U／mL）誘導下培養，獲得無限增殖能力［10］，即永生化溫度敏感小鼠內皮細胞系HSMEC（heat-sensitivemouse endothelium cell）。阿霉素100 μg／mL加入培養的HSMEC，作用24 h。此后分為6組，分別加入A、B、C、D、E、F組的血清凍干粉培養48 h。

1.4 24 h尿蛋白測定 分別在注射ADR第0、1、2、3周將大鼠置于清潔代謝籠內，留取24 h尿液，采用鄰苯三酚紅／鉬酸鹽法檢測24 h尿蛋白定量。

1.5 血清生化指標檢測 分別在實驗進行的第0、3、7周，隨機選取各組大鼠8只，10%水合氯醛麻醉，分離腹主動脈，抗凝管采集5 mL動脈血，3 000 r／min離心20 min，收集血清，全自動生化分析儀檢測血清白蛋白（ALB）、血脂（TCH、TG）、腎功能（BUN、Cr）。

1.6 Western Blotting檢測VEGF、FLK-1蛋白的表達水平 提取各組細胞總蛋白，采用Western Blotting法檢測VEGF、FLK-1蛋白的表達，用Quantity One軟件測每條帶光密度值。

1.7 RT-PCR檢測VEGF、FLK-1 mRNA的表達 采用Trizol提取細胞總RNA，以RNA為模板，經逆轉錄酶及引物水浴30 min合成cDNA，95℃5 min滅活逆轉錄酶，產物作為PCR模板。VEGF引物序列：正鏈引物5′-ACTGGACCCTGGCTTTACTGC-3′，負鏈引物 5′-TTGGTGAGGTTTGA TCCGCA TG-3′，擴增產物長度為310 bp；FLK-1引物序列：正鏈引物5′-CGTCCTCAAAGCATCAGCAT-3′，負鏈引物 5′-CTACGCCCTTTGATGTGCCA-3′擴增產物長度為406 bp；內參β-actin：引物序列：正鏈引物5′-CTCTGGTCGTACCACTGGCATTG-3′，5′-CCTGCTTGCTGATCCACA TCTGC-3′擴增產物長度為680 bp。

1.8 統計學方法 采用統計軟件SPSS 19.0進行分析，計量數據采用均數±標準差（±s）表示，多組之間采用單因素方差分析進行比較，以 P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組24 h尿蛋白測定比較 見表1。

表1 各組24 h尿蛋白測定比較（±s，n＝30）mg／24h

表1 各組24 h尿蛋白測定比較（±s，n＝30）mg／24h

注：與對照組相應時間比較 ，＃P＜0．05，＃＃P＜0．01

組 別 0周 1周 2周 3周對照組 7．91±2．02 8．11±1．98 8．36±2．31 7．88±2．13模型組 8．01±2．1118．34±6．45＃54．32±12．24＃＃68．62±11．31＃＃

2.2 各組血清生化指標檢測比較 見表2。

表2 各組血清生化指標比較（±s，n＝8）

表2 各組血清生化指標比較（±s，n＝8）

注：與A組相應時間比較 ，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；與B組相應時間比較 ，△P＜0.05，△△P＜0.01

組 別 時間／周 ALB／（g／L） TCH／（mmol／L） TG／（mmol／L） BUN／（mmol／L） Cr／（μmol／L）A組 0 30．80±1．46 1．95±0．39 2．30±0．91 5．78±1．09 45．30±8．61 3 30．47±0．93 2．00±0．32 2．47±0．95 5．99±0．92 45．13±5．65 7 30．77±1．15 1．98±0．31 2．77±0．57 6．03±0．89 48．43±8．07 B組 0 30．22±1．59 1．99±0．23 2．72±0．88 5．73±0．95 45．05±8．44 3 26．83±1．38＃＃ 6．83±1．38＃＃ 5．62±0．56＃＃ 6．73±1．07 58．49±7．12＃＃7 27．01±1．59＃＃ 6．24±1．11＃＃ 5．73±0．92＃＃ 6．92±0．87 56．68±8．89 C組 7 29．68±1．24△△ 3．98±1．08＃＃△△ 5．51±1．09＃＃ 5．73±0．77 49．61±9．33 D組 7 27．84±1．35＃ 3．78±1．06＃＃△△ 5．18±1．21＃＃ 5．92±0．82 50．95±9．12 E組 7 29．85±1．35△△ 3．18±1．22＃△△ 6．86±0．54＃＃△ 6．46±1．03 48．77±9．04 F組 7 27．75±2．31＃ 3．36±1．34＃△△ 5．42±1．04＃＃ 6．22±1．04 49．82±8．93

2.3 Western Blotting檢測VEGF、FLK-1蛋白的表達水平 見圖1。

圖1 各組VEGF、FLK-1蛋白表達的比較

2.4 RT-PCR檢測VEGF及FLK-1 mRNA的表達 見圖2。

圖2 各組VEGF、FLK-1mRNA表達的比較

3 討論

蛋白尿是CKD的一個常見癥狀，也是較難解決的臨床癥狀之一［11］。腎小球濾過屏障的破壞與蛋白尿的發生與有著密切的關聯［12］，濾過膜由腎小球內皮細胞、基底膜和足細胞共同構成，研究［13］證實小鼠體內VEGF表達的異常，其濾過膜形成發生障礙，結果提示，VEGF的表達情況可能與濾過膜的形成過程及蛋白尿的發生有著密切的關系。另有研究［14］證實，在維持和調控腎小球濾過功能正常運行的方面，VEGF及其受體可能起著重要作用，并參與了實驗性非糖尿病動物模型腎臟微血管結構的改變。

本實驗在前期研究的基礎上，采用ADR一次性給予大鼠尾靜脈注射，3周后根據大鼠24 h尿蛋白含量的結果，提示成功構建大鼠腎病模型。本研究巧妙的運用給藥后的大鼠血清作為治療ADR損傷的內皮細胞的藥物來源，避免了因直接加藥所帶來的不確定因素。觀察VEGF及其受體FLK-1的表達，結果顯示ADR損傷的內皮細胞VEGF、FLK-1蛋白及mRNA的表達均升高，提示ADR可能導致內皮細胞通透性的改變，給予相應的血清治療后，VEGF、FLK-1蛋白及mRNA的表達有不同程度的下調，其中以祛風通絡方及強的松下調效果顯著。然而，腎上腺皮質類激素雖然在治療腎病綜合征方面有顯著的效果，但由于其亦引起各種不良反應，在臨床使用中非常謹慎。此外本研究結果亦表明祛風通絡方在治療大鼠腎病效果方面優于血管緊張素轉化酶抑制劑苯那普利 ，祛風通絡方聯合激素治療效果并不理想，其具體機制還不明確。這些結果表明，祛風通絡方能夠降低腎病大鼠模型的尿蛋白含量，改善腎小球內皮細胞的功能，在治療腎病上有著顯著的優勢。

綜上，祛風通絡方能夠下調腎小球內皮細胞VEGF及其受體FLK-1的表達，改善阿霉素大鼠腎病模型的腎功能，值得臨床上進一步研究。

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Qufengtongluo recipe on expression of VEGF and its receptor FLK-1in adriamycin-induced rat glomerular endothelial cell

WANG Juan1，CUI Zhijun2，MA Qiaoya1，WANG Zhu1，SUN Wangsen1*
（1．The Newsroom of Chinese Journal of Dermatovenereology，Second Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University，Xi'an 710004，China；2．Emergency Department，Shanxi Traffic Hospital，Xi'an 710004，China）

Objective To study the effects of qufengtongluo recipe on the expression of VEGF and its receptor FLK-1 in adriamycin-induced rat glomerular endothelial cell．Methods The 30 out of 130 SD rats are used as the control group（A），and the remaining rats are given intravenously adriamycin one-time injecting to construct nephropathy model，and after the model is successfully constructed，rats are randomly divided into model group（B，n＝18），qufengtongluo eecipe group（C group，n＝18），qufeng and hormone group（qufengtongluo recipe and hormones share group，D，n＝18），hormone group（E，n＝18），benazepril group（F，n＝18），to build adriamycin-induced glomerular endothelial cells models，and to give the appropriate serum for treatment，and pyrogallol red／molybdate method is used to detect 24 h urinary protein；automatic biochemical analyzer is used to detect serum albumin（ALB），lipids（total cholesterol，TCH；Triglycerides，TG），renal function（blood urea nitrogen，BUN；serum creatinine，Cr）and RT-PCR；western bloting and RT-PCR are used to detect the expression of VEGF andFLK-1 in the cells．Results Both C，E group can elevate serum ALB，decrease serum TCH，and the differences are significant comparing with group B（P＜0．01）；after glomerular endothelial cells are damaged by ADR，the expression of VEGF and FLK-1proteinand mRNA in group B is higher than that in group A，the difference is significant（P＜0．01），and after adding the appropriate serum lyophilized powder，the expression of VEGF and FLK-1 protein and mRNA in group C，E are down-regulated compared with group B（P＜0．01）．Conclusion Qufengtongluo recipe can decrease expression of VEGF and its receptor FLK-1 in glomerular endothelial cells，and improve renal function in rats with Adriamycininduced nephropathy model．

Qufengtongluo recipe；VEGF；FLK-1；renal function

R285.5

A

2095-6258（2015）05-0897-04

10．13463／j．cnki．cczyy．2015．05．006

2015-02-25）

陜西省科技計劃項目基金（2004K16-G9）；西安交通大學基本科研業務費自由探索與自主創新類項目（08143035）；西安交通大學醫學院第二附屬醫院院基金重點項目〔YJ（ZD）201203〕。

王 娟（1980-），女，碩士，主治醫師，主要從事中西醫結合腎病方向研究。

*通信作者：孫萬森，男，碩士，主任醫師，電話-15829282087，電子信箱-wangjuan8002＠126．com

C、E組能升高大鼠血清ALB的含量，降低血清TCH的含量，與B組比較，差異均有統計學意義（P＜0.01）；腎小球內皮細胞經阿霉素損傷后，B組較A組VEGF、FLK-1蛋白及mRNA的表達均升高，差異有統計學意義（P＜0.01），各組加入相應血清凍干粉后，C、E組VEGF、FLK-1蛋白表達均下調，與B組比較，差異有統計學意義（P＜0.01）。結論 祛風通絡方能夠下調腎小球內皮細胞VEGF及其受體FLK-1的表達，改善阿霉素大鼠腎病模型的腎功能。