二苯乙烯苷和三七總皂苷配伍對(duì)Aβ25-35致PC12細(xì)胞損傷影響的研究

張運(yùn)輝,伍大華*,袁春云，張秀麗，彭文杰，姚 婷

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院附屬中西結(jié)合醫(yī)院，湖南 長沙410006；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中藥粉體實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410208）

阿爾茨海默病（Alzheimer's disease AD)是一種以進(jìn)行性癡呆為主的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的退行性疾病。臨床上以何首烏和三七為主的補(bǔ)腎活血復(fù)方益智健腦顆粒用于AD 的治療取得了很好的療效[1-2]。AD患者膽堿能系統(tǒng)損傷后，乙酰膽堿酯酶（AchE）活性在多處腦區(qū)均顯著升高，其變化程度與癡呆等級(jí)呈相關(guān)[3-4]。 丙二醛（MDA)含量、超氧化物歧化酶（SOD)活性是評(píng)估AD 氧化應(yīng)激損傷的重要標(biāo)志[5]。已有研究表明，二苯乙烯苷（TSG）能降低AD 模型大鼠的AchE 活性[6]，并通過抗氧化應(yīng)激損傷作用明顯減少人β 淀粉樣蛋白25-35（Aβ25-35）引起的PC12 細(xì)胞損傷，提高細(xì)胞活力[7]。 三七總皂苷（PNS）能改善膽堿能系統(tǒng)、抗氧化應(yīng)激損傷[8-9]。 我們前段研究預(yù)實(shí)驗(yàn)表明，二苯乙烯苷（TSG）100 mmol/L 和PNS 50 mg/L分別是抗阿爾茨海默病損傷的有效劑量，且兩者配伍對(duì)神經(jīng)元損傷有協(xié)同或相加的效應(yīng)。 本文從膽堿能系統(tǒng)損傷和氧化應(yīng)激損傷兩方面探討TSG 和PNS 配伍對(duì)AD 損傷的保護(hù)機(jī)制， 現(xiàn)將實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞

大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜絡(luò)細(xì)胞瘤細(xì)胞株P(guān)C12 細(xì)胞，高分化，永久性，購自長沙贏潤生物技術(shù)有限公司，編號(hào)2015032007。

1.2 試劑

TSG （北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院, 批號(hào)130725，純度97%），PNS（北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，批號(hào)MUST-14042810，純度98%），Aβ25-35（美國Sigma 公司，批號(hào)053M4804V 純度98%），鹽酸多奈哌齊片（中國衛(wèi)材藥業(yè)有限公司），DMSO（Sigma 公司），F(xiàn)BS（吉泰遠(yuǎn)成生物科技有限公司），MDA 試劑盒、SOD 試劑盒、AchE 試劑盒、MTT、胰酶均由南京建成生物工程研究所提供，DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)液 （賽默飛世爾生物化學(xué)制品北京有限公司），10%新生小牛血清（Hyclone Lab），PBS（北京索萊寶科技有限公司）。

1.3 儀器

Galaxy 170R 型二氧化碳培養(yǎng)箱（上海百賽生物技術(shù)有限公司），DL-CJ-2NDI 型超凈工作臺(tái)(中國北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司），5804R 型低溫高速離心機(jī)(德國Eppendorf 5810R)，Primo Vert型倒置顯微鏡(德國 Carl Zeiss Jena)，UV1800ENG240V 型 紫 外 分 光光度計(jì)[島津（中國）有限公司]等。

2 方法

2.1 PC12 細(xì)胞培養(yǎng)

用含10%胎牛血清和5%馬血清的DMEM,在95%O2、5%CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)細(xì)胞， 每2 天傳代1次， 待細(xì)胞增長至80%融合時(shí)， 用0.25%胰酶消化細(xì)胞， 調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1×105個(gè)/mL 后傳代或接種于細(xì)胞培養(yǎng)板，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 藥物配制

將TSG、PNS、Aβ25-35、 多奈哌齊分別配成初始濃度為2 000 mmol/L、1 000 mg/L、400 μmol/L、200 μmol/L。藥物干預(yù)時(shí)，再分別取5 μL 加至100 μL 的細(xì)胞培養(yǎng)基中稀釋20 倍。

2.3 藥物配伍劑量的確定

前段研究表明，TSG（100 mmol/L）和PNS（50 mg/L）分別是抗阿爾茨海默病損傷的的有效劑量， 且兩者配伍對(duì)神經(jīng)元損傷有協(xié)同或相加的效應(yīng)。

2.4 分組及藥物干預(yù)

文獻(xiàn)[10]表明，Aβ25-35能劑量依賴性地?fù)p傷皮質(zhì)神經(jīng)元,1 μmol/L Aβ25-35劑量組處理24 h 后細(xì)胞存活率可降低50%左右, 可用于Aβ25-35體外誘導(dǎo)阿爾茨海默病細(xì)胞模型的建立[10]。 故本實(shí)驗(yàn)選用Aβ25-35誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞建立AD 損傷模型。

待PC12 細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期后， 以2×104/mL密度， 隨機(jī)接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中， 每孔100 μL，每組8 孔，共6 組。24 h 后，吸取培養(yǎng)液，細(xì)胞分成6 組進(jìn)行藥物干預(yù)：（1） 空白組（正常PC12細(xì)胞）；（2）模型組（20 μmol/L Aβ25-35）；（3）多奈哌齊組（20 μmol/L Aβ25-35+10 μmol/L 多奈哌齊）（4）TSG組 （20 μmol/L Aβ25-35+100 mmol/L TSG）；（5）PNS組(20 μmol/L Aβ25-35+50 mg/L PNS；（6）TSG-PNS（20 μmol/L Aβ25-35+100 mmol/L TSG+50 mg/L PNS）組，繼續(xù)孵育24 h。

2.5 PC12 細(xì)胞中AchE 及SOD 活力、MDA 含量檢測(cè)

完成加藥孵育24 h 后， 采用細(xì)胞刮徹底收集細(xì)胞， 超聲破碎細(xì)胞，4 ℃下3 000 r/min 離心10 min， 收集上清液按照試劑盒方法測(cè)定細(xì)胞均漿中的AchE 及SOD 活力、MDA 含量。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

與空白組比較， 模型組AchE 活力、MDA 含量顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，AchE 活力、MDA含量在各組顯著降低（P＜0.05），且配伍組及多奈哌齊組比TSG 組和PNS 單用組降低更明顯 （P＜0.01，P＜0.05）。

與空白組比較，模型組SOD 活力顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，SOD 活力在各組顯著升高（均P＜0.05），配伍組及多奈哌齊組均升高明顯（P＜0.01，P＜0.05）， 且配伍組比TSG 組和PNS 單用組升高更明顯（均P＜0.01）。 見表1。

表1 各組PC12 細(xì)胞上清液中AchE 及SOD 活力、MDA 含量的比較 （±s,n=8）

表1 各組PC12 細(xì)胞上清液中AchE 及SOD 活力、MDA 含量的比較 （±s,n=8）

注：與空白組比較△△P＜0.01;與模型組比較★P＜0.05,★★P＜0.01；與TSG-PNS 配伍組比較☆P＜0.05,☆☆P＜0.01。

MDA(nmol/L)8.48±0.56 11.29±0.82△△9.06±0.65★☆9.24±0.68★☆☆7.06±0.40★★8.65±0.59★★☆組別空白組模型組TSG PNS TSG-PNS多奈哌齊組AchE(U/mL)25.00±2.52 20.00±2.34△△12.00±1.25★★☆☆15.00±1.54★☆☆5.00±0.76★★8.00±1.08★★☆SOD（U/mL)251.33±9.84 111.42±4.98△△152.79±10.32★☆☆173.61±10.50★☆☆290.86±16.30★★272.53±15.82★★☆☆

4 討論

上世紀(jì)70年代，研究發(fā)現(xiàn)AD 患者基底前腦去膽堿能神經(jīng)元丟失，從基底節(jié)到皮質(zhì)，膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶（ChAT）活性降低和乙酰膽堿酯酶（AChE）活性明顯升高，造成乙酰膽堿（ACh）的合成，儲(chǔ)存和釋放減少，皮質(zhì)ACh 受體數(shù)目減少，導(dǎo)致以學(xué)習(xí)記憶減退和認(rèn)知障礙為主的多種臨床表現(xiàn)， 產(chǎn)生AD 癥狀[11]。AD 病人體內(nèi)自由基生成增加， 尤其是腦組織中神經(jīng)細(xì)胞的氧化應(yīng)激是導(dǎo)致其腦結(jié)構(gòu)和功能改變的原因[12]。 超氧化物歧化酶（SOD)屬于生物抗氧化酶類，被稱為生物體抗氧化系統(tǒng)的第一道防線。 丙二醛 （MDA) 屬于脂質(zhì)過氧化物標(biāo)志物。 實(shí)驗(yàn)證明，MDA 的水平在AD 腦內(nèi)顯著提高[13]。 一旦自由基產(chǎn)生和清除的平衡狀態(tài)被打破，自由基堆積，對(duì)機(jī)體造成氧化損傷，促使AD 的發(fā)生。 因此，膽堿能系統(tǒng)損傷、氧化應(yīng)激自由基損傷是AD 發(fā)病的重要機(jī)制。我們前期預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，40 μmol/L 濃度范圍內(nèi)，Aβ25-35對(duì)PC12 細(xì)胞損傷存在濃度依耐性， 隨著濃度的升高，細(xì)胞發(fā)生聚集、脫落，呈彌漫狀，細(xì)胞存活率也成線性降低；當(dāng)損傷濃度升高至40 μmol/L，鏡下視野幾乎無細(xì)胞存活，對(duì)細(xì)胞的損傷達(dá)到頂峰。 考慮到Aβ25-35的嚴(yán)重致?lián)p作用可能導(dǎo)致PC12 細(xì)胞不可逆轉(zhuǎn)性的損傷，故我們選取20 μmol/L 的Aβ25-35作用PC12 細(xì)胞建立AD 體外細(xì)胞模型。

本研究結(jié)果表明，Aβ25-35誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞建立AD 損傷模型后，模型組上清液AchE 活力、MDA 含量顯著升高、SOD 活力明顯降低， 說明AD 模型PC12 細(xì)胞的膽堿能系統(tǒng)和自由基清除系統(tǒng)發(fā)生嚴(yán)重障礙。 藥物干預(yù)后TSG、PNS、TSG-PNS 可降低AchE 活力、MDA 含量、提高SOD 活力。且TSG-PNS配伍組的效應(yīng)比TSG 或PNS 單用組更好。 TSG 和PNS 配伍治療AD 的機(jī)制可能是通過改善膽堿能損傷和抑制氧化應(yīng)激損傷來實(shí)現(xiàn)的。

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