西爾斯山羊草(Aegilopssearsii)α-醇溶蛋白編碼基因的克隆及原核表達(dá)

劉國(guó)娟,馬信,尹華燕,孫鑫,杜旭燁,王宏偉,李安飛,陳呈濤,孔令讓*

1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/作物生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東泰安271018

2.山東省新泰市天寶鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站,山東新泰271200

西爾斯山羊草(Aegilopssearsii)α-醇溶蛋白編碼基因的克隆及原核表達(dá)

劉國(guó)娟1,馬信1,尹華燕1,孫鑫1,杜旭燁1,王宏偉1,李安飛1,陳呈濤2,孔令讓1*

1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/作物生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東泰安271018

2.山東省新泰市天寶鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站,山東新泰271200

醇溶蛋白是小麥加工品質(zhì)的重要影響因素，主要決定面團(tuán)的粘性和延展性。根據(jù)酸性條件下遷移率的不同，可將醇溶蛋白分為α-，β-，γ-，ω-醇溶蛋白。α-醇溶蛋白占貯藏蛋白的15%～30%，是含量最豐富的一類(lèi)貯藏蛋白，同時(shí)，α-醇溶蛋白中含有一些致敏性的毒性多肽。克隆西爾斯山羊草α-醇溶蛋白基因，并進(jìn)行序列分析，通過(guò)構(gòu)建原核表達(dá)載體，使其在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白，并通過(guò)切膠純化法，獲得純度較高的目的蛋白。根據(jù)α-醇溶蛋白基因編碼區(qū)保守序列設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增克隆得到α-醇溶蛋白基因并進(jìn)行序列分析。將目的基因KC421089連到表達(dá)載體pEASY-E1上，在大腸桿菌BL21（DE3）中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，獲得表達(dá)的融合蛋白。通過(guò)切膠純化法，獲得純度較高的目的蛋白。從小麥近緣植物西爾斯山羊草（Aegilops searsii）中首次克隆了7個(gè)α-醇溶蛋白編碼基因，它們的編碼區(qū)長(zhǎng)度分布在849～954 bp之間，可編碼282～317個(gè)氨基酸。通過(guò)與已發(fā)表的其它物種的α-醇溶蛋白氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)這些基因都具有α-醇溶蛋白編碼基因典型的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，同時(shí)還存在著堿基的缺失、插入以及SNPs。在克隆目的基因的基礎(chǔ)上，本研究還通過(guò)大腸桿菌體外表達(dá)和切膠純化方法，獲得了純度較高的目的蛋白，實(shí)現(xiàn)了該基因的表達(dá)。克隆了7個(gè)α-醇溶蛋白基因序列，登錄號(hào)為KC421089的基因可在原核系統(tǒng)中成功表達(dá)，并通過(guò)切膠純化法獲得目的蛋白，為進(jìn)一步利用西爾斯山羊草改良小麥加工品質(zhì)奠定了基礎(chǔ)。

α-醇溶蛋白;西爾斯山羊草;序列分析;原核表達(dá)

醇溶蛋白是小麥種子中的主要貯藏蛋白之一，約占小麥胚乳貯藏蛋白總量的50%～60%[1]，是影響小麥加工品質(zhì)的重要因素。在酸性電泳中，根據(jù)遷移率大小可將其分為α-，β-，γ-，ω-醇溶蛋白[2,3]。其中，α-醇溶蛋白占小麥籽粒總蛋白的15～30%[4-6]，平均分子量為31 kD，主要由位于第六同源染色體群短臂上的Gli-2（Gli-A2，Gli-B2和Gli-D2）位點(diǎn)控制[7]。

乳糜瀉(Celiac disease,CD)又稱(chēng)為小麥麩質(zhì)過(guò)敏，是小麥誘發(fā)的一種特殊過(guò)敏癥狀，臨床表現(xiàn)為腸黏膜損害和繼發(fā)性吸收不良并伴有頑固腹瀉、體重下降、營(yíng)養(yǎng)不良、骨質(zhì)疏松癥、貧血、乏力、手足抽搐等癥狀，嚴(yán)重影響食品安全和人類(lèi)健康[8]。α-醇溶蛋白基因編碼的氨基酸序列中含有能夠誘發(fā)CD的毒性多肽序列，這些多肽序列與病人的T細(xì)胞結(jié)合會(huì)產(chǎn)生小腸粘膜損傷和吸收不良癥狀。朱西平等根據(jù)推導(dǎo)氨基酸序列所具有的四種CD多肽結(jié)構(gòu)，對(duì)普通小麥品種中克隆的α-醇溶蛋白基因進(jìn)行染色體定位，并用中國(guó)缺-四體對(duì)該染色體定位方法進(jìn)行驗(yàn)證[9]。目前，對(duì)普通小麥中CD多肽的研究已有些報(bào)道，并確認(rèn)了一系列的毒性多肽，但是關(guān)于二倍體材料中CD抗原多肽的研究還相對(duì)較少。

對(duì)基因功能研究的方法主要有轉(zhuǎn)基因、體外表達(dá)、基因沉默等。原核表達(dá)是一種重要的體外表達(dá)模式，在基因功能研究方面發(fā)揮了重要作用。Claudia等[10]和Ferrante等[11]利用E.coli表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了普通小麥γ-醇溶蛋白基因的原核表達(dá)，并通過(guò)體外摻粉實(shí)驗(yàn)對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了體外功能驗(yàn)證。由于α-醇溶蛋白序列具有較高的多態(tài)性，對(duì)蛋白的純化及表達(dá)技術(shù)提出了較高的要求，因此對(duì)其進(jìn)行體外功能鑒定的研究尚處于起步階段，有必要對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

西爾斯山羊草是小麥近緣種，是小麥育種改良的重要資源，本研究旨在從西爾斯山羊草中克隆出α-醇溶蛋白的編碼基因，并通過(guò)原核表達(dá)初步驗(yàn)證該基因功能，為今后進(jìn)一步利用西爾斯山羊草改良小麥面粉加工品質(zhì)奠定分子基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

西爾斯山羊草Y2131（Aegilops searsii,SsSs,2n=2x=14），由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所提供。

1.2 基因組DNA提取

采用CTAB法從西爾斯山羊草的幼葉中進(jìn)行植物總DNA的提取[12]。

1.3 基因的克隆及序列分析

根據(jù)GenBank公布的α-醇溶蛋白基因的保守序列，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增編碼區(qū)全長(zhǎng)，引物序列為，P1：5'-ATG AAG ACC TTT CTC ATC CTT G-3'，P2：5'-TCA GTT RGT ACC RAA GAT GCC-3'。利用在線軟件http://web.expasy.org/translate/進(jìn)行氨基酸的翻譯，并利用MEGA 5.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建；同時(shí)，在利用DNAMAN軟件進(jìn)行序列比對(duì)分析的基礎(chǔ)上，辨識(shí)CD毒性多肽的識(shí)別區(qū)域（參照朱西平等的方法進(jìn)行[8]）。

1.4 原核表達(dá)與純化

根據(jù)目的基因的完整編碼區(qū)，設(shè)計(jì)一對(duì)引物擴(kuò)增不含有信號(hào)肽編碼序列的ORF，引物序列為，P3：5'-GCA GTT AGA GTT CCA GTG CCA-3'，P4：5'-TCA GTT RGT ACC RAA GAT GCC-3'，將目的片段回收純化后連接到pEASY-E1載體上，轉(zhuǎn)化至Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中，并進(jìn)行菌液測(cè)序。對(duì)測(cè)序正確的菌液進(jìn)一步提取質(zhì)粒DNA，并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單克隆，經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證正確后進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，然后通過(guò)切膠純化法得到目的蛋白[13,14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 α-醇溶蛋白的克隆及序列分析

圖1 西爾斯山羊草α-醇溶蛋白基因的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of the α-gliadin gene from Aegilops searsii M:DL2000;1:Y2131

利用一對(duì)保守引物P1和P2，對(duì)西爾斯山羊草基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，得到約1000 bp左右的目的條帶（圖1），經(jīng)測(cè)序共獲得7個(gè)基因，通過(guò)在Genbank中的在線搜索，結(jié)果顯示它們與已知的α-醇溶蛋白基因具有很高的相似性，同時(shí)與已報(bào)道的基因在序列上存在一定差異，表明本試驗(yàn)得到的α-醇溶蛋白編碼基因均為新的α-醇溶蛋白基因。隨后，將這些基因序列提交至Genbank（登錄號(hào)：KC421084-KC421090）。對(duì)核苷酸序列編碼的氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)核苷酸序列長(zhǎng)度為849-954 bp（表1），編碼氨基酸數(shù)目為282～317個(gè)，等電點(diǎn)具有較高的多態(tài)性。通過(guò)與已發(fā)表的α-醇溶蛋白序列進(jìn)行多重比對(duì)分析（圖2），這些基因都具有α-醇溶蛋白編碼基因典型的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)[15]，并且都具有6個(gè)半胱氨酸殘基，同時(shí)還存在著堿基的缺失、插入以及SNPs。

表1 西爾斯山羊草α-醇溶蛋白的特征分析Table 1 Characterization of 7 novel α-gliadin from Aegilops searsii

圖2 西爾斯山羊草α-醇溶蛋白基因序列與斯卑爾脫小麥的AJ130948，圓錐小麥的DQ140351，栽培一粒小麥的DQ401698的推導(dǎo)氨基酸序列比較注:△表示保守的半胱氨酸殘基，方框中的序列為glia-α毒性多肽Fig.2 The deduced amino acid sequences of Aegilops searsii α-gliadin genes compared with Triticum spelta derived sequence AJ130948; Triticum turgidum derived sequence DQ140351 and Triticum monococcum derived sequence DQ401698Note:△represents conserved cysteine residues.The boxed letters are glia-α toxic epitope

2.2 CD毒性多肽的識(shí)別與分析

研究表明，在α-醇溶蛋白中共含有4種毒性多肽，分別為glia-α9，glia-α20，glia-α，glia-α2，它們的分布存在基因組特異性。A基因組編碼的α-醇溶蛋白含有g(shù)lia-α9和glia-α20，B基因組編碼的α-醇溶蛋白不含有或者僅含有g(shù)lia-α，而來(lái)源于D基因組編碼的α-醇溶蛋白含有三種或者全部4種毒性多肽[6]。對(duì)本實(shí)驗(yàn)中獲得的α-醇溶蛋白的毒性多肽進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)它們都只含有g(shù)lia-α毒性多肽（表2），符合B染色體編碼的α-醇溶蛋白的特征。

表2 西爾斯山羊草α-醇溶蛋白具有的T細(xì)胞抗原表位數(shù)量及類(lèi)型Table 2 Number and type of the four T cell stimulatory toxic epitopes in the α-gliadin from Aegilops searsii

2.3 α-醇溶蛋白聚類(lèi)分析

將克隆得到的核苷酸序列和Genbank中具有α-醇溶蛋白完整編碼閱讀框的序列進(jìn)行同源比對(duì)，構(gòu)建Neighbor-joining樹(shù)（圖3）。結(jié)果顯示，共形成了4個(gè)大的分支，分別是A基因組、D基因組、Ss基因組和B基因組編碼的α-醇溶蛋白基因。其中，有兩個(gè)Ss基因組基因和D基因組基因親緣關(guān)系較近，此外，大多數(shù)來(lái)源于Ss基因組的α-醇溶蛋白與來(lái)源于小麥B基因組的α-醇溶蛋白親緣關(guān)系相對(duì)較近，但是，二者卻位于兩個(gè)不同的分支。

圖3 α-醇溶蛋白基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of α-gliadin genes.

2.4 基因的誘導(dǎo)表達(dá)與檢測(cè)

將登錄號(hào)為KC421089的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入宿主菌BL21(DE3)中，挑取單克隆培養(yǎng)，培養(yǎng)物按一定比例接種于選擇培養(yǎng)基，當(dāng)OD600達(dá)到0.6時(shí)，加入IPTG誘導(dǎo)劑，然后在37°C條件下誘導(dǎo)表達(dá)10 h。用蛋白提取液提取總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果表明，在18.8～35KD之間有一條誘導(dǎo)出的明顯的蛋白條帶，與預(yù)測(cè)的蛋白分子量大小基本吻合。隨后將其進(jìn)行切膠純化，得到純度較高的目的蛋白（圖4）。目的蛋白的成功誘導(dǎo)表達(dá)及純化，為研究西爾斯山羊草α-醇溶蛋白基因?qū)π←溂庸て焚|(zhì)的效應(yīng)奠定了理論基礎(chǔ)。

圖4 誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物和純化產(chǎn)物的SDS-PAGE鑒定分析注:1:未誘導(dǎo)的BL21(DE3);2:誘導(dǎo)后的BL21(DE3);3:未誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化空載體的菌株;4:誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化空載體的菌株; 5:Marker;6:轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒后未經(jīng)誘導(dǎo)的菌株;7:轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒經(jīng)誘導(dǎo)的菌株;8:純化的目的蛋白Fig.4Analysis of expressed and purified proteins by SDS-PAGENote:1:Protein of BL21(DE3)without induction;2:Protein of BL21(DE3)induced by IPTG;3:BL21(DE3)with pEASY-E1 without induction;4: BL21(DE3)with pEASY-E1 induced by IPTG;5:Protein molecular weight marker;6:Protein of recombinant plasmid without induction;7:Protein of recombinant plasmid induced by IPTG;8:Purified protein.

3 討論

小麥面筋中常常含有對(duì)乳糜瀉病人具有毒性的多肽，這些多肽通過(guò)激活人體內(nèi)免疫系統(tǒng)的T細(xì)胞，使人體產(chǎn)生一定的炎癥，從而影響人們的健康。目前，對(duì)預(yù)防CD的最有效措施是嚴(yán)格避免攝入含致敏源的食品。前人研究表明，面筋中含有的CD毒性多肽的種類(lèi)和數(shù)量越多，CD的發(fā)病率也越高[16]。Van Herpen等人研究表明，在小麥B基因組中克隆到的α-醇溶蛋白基因序列一般不含有毒性多肽[6]，而在本實(shí)驗(yàn)中克隆獲得的來(lái)源于Ss基因組的序列都含有g(shù)lia-α毒性多肽，α-醇溶蛋白中的毒性多肽在Ss基因組和小麥B基因組上存在較大差異，因此，在利用該材料進(jìn)行小麥新品種培育時(shí)，應(yīng)避免含有毒性多肽α-醇溶蛋白的引入。

前人研究表明，烏拉爾圖小麥?zhǔn)切←淎基因組的供體，粗山羊草是小麥D基因組的供體[17]，而關(guān)于小麥B基因組的供體目前還沒(méi)有定論。一般認(rèn)為擬斯卑爾脫山羊草單獨(dú)或與其近緣植物共同作為小麥B基因組的供體[15]。本研究結(jié)果表明，栽培一粒小麥和烏拉爾圖小麥親緣關(guān)系較近，粗山羊草與小麥D基因組親緣關(guān)系較近，而來(lái)源于西爾斯山羊草的α-醇溶蛋白與來(lái)源于小麥B基因組的α-醇溶蛋白盡管表現(xiàn)出一定的同源性，但卻分布在兩個(gè)不同的分支（圖3），說(shuō)明Ss基因組可能沒(méi)有參與小麥B基因組的進(jìn)化過(guò)程。

蛋白的體外表達(dá)為小麥種子貯藏蛋白的功能研究提供了一條有效途徑[11]。蛋白體外摻粉實(shí)驗(yàn)需要將外源的醇溶蛋白添加到基礎(chǔ)面粉中，然后用揉混儀進(jìn)行測(cè)定即可得知其對(duì)小麥品質(zhì)的影響，為研究醇溶蛋白對(duì)面粉加工品質(zhì)的影響提供了更快速、更簡(jiǎn)便的途徑。目前，雖然通過(guò)克隆獲得了大量的醇溶蛋白基因，但是對(duì)其進(jìn)行功能驗(yàn)證的研究還相對(duì)較少。本研究通過(guò)大腸桿菌原核表達(dá)以及切膠純化的方法，獲得了純度較高的目的蛋白，初步實(shí)現(xiàn)該目的基因的表達(dá)，所獲得的表達(dá)產(chǎn)物可用于后續(xù)的體外摻粉實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證其對(duì)面粉加工品質(zhì)的影響。

4 結(jié)論

4.1 α-醇溶蛋白基因的克隆和序列分析

本研究首次從西爾斯山羊草中克隆得到7個(gè)α-醇溶蛋白基因，登錄號(hào)分別為KC421084-KC421090；序列分析表明，這7個(gè)基因序列都具有α-醇溶蛋白基因家族的結(jié)構(gòu)特征，并且都含有6個(gè)半胱氨酸殘基（圖2），系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，栽培一粒小麥和烏拉爾圖小麥親緣關(guān)系較近，粗山羊草與小麥D基因組親緣關(guān)系較近，而來(lái)源于西爾斯山羊草的α-醇溶蛋白與來(lái)源于小麥B基因組的α-醇溶蛋白盡管表現(xiàn)出一定的同源性，但卻分布在兩個(gè)不同的分支。

4.2 α-醇溶蛋白基因的原核表達(dá)

將登錄號(hào)為KC421089的西爾斯山羊草α-醇溶蛋白基因與原核表達(dá)載體連接，并成功地在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了表達(dá)，獲得了與理論值相符的融合蛋白。此外，本實(shí)驗(yàn)還通過(guò)切膠純化法獲得了純度較高的目的蛋白，對(duì)研究西爾斯山羊草α-醇溶蛋白基因的品質(zhì)效應(yīng)提供了理論參考。

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Cloning and Prokaryotic Expression of α-Gliadin Genes from Aegilops searsii

LIU Guo-juan1,MA Xin1,YIN Hua-yan1,SUN Xin1,DU Xu-ye1,WANG Hong-wei1,LI An-fei1,CHEN Cheng-tao2,KONG Ling-rang1*
1.Agronomy College,Shandong Agricultural University/State Key Laboratory of Crop Biology,Taian 271018,China
2.Agriculture Technology Generalization Station of Tianbao Town Xintai City Shandong Province,Xintai 271200,China

Gliadins are the major influence factors of wheat processing quality,which determine dough extensibility.On the basis of the electrophoretic mobility by acidic polyacrylamide gel electrophoresis,gliadin can be separated into α-，β-，γ-and ω-gliadin.Among them,α-gliadins are the most abundant and accounted for 15%～30%of the wheat storage proteins.On the other hand,α-gliadins can cause different diseases.The present study aimed at cloning and analyzing the α-gliadin genes from Aegilops searsii,expressing it in E.coli and obtaining high purified proteins.The α-gliadin genes were amplified by PCR and then inserted the gene KC421089 into pEASY-E1.The recombinant plasmids were expressed in the E.coli BL21(DE3)and then the purified proteins were obtained by cutting the gel slices.Seven novel α-gliadin genes were cloned from Aegilops searsii.Their length of the open reading frames ranged from 849-954bp,encoding the putative proteins with 282-317 amino acid residues,respectively.A BLAST search showed that these sequences have the typical structure of α-gliadin genes and SNPs and In/Dels.Moreover,the target proteins were expressed by E.coli and highly purified proteins were obtained by cutting the gel slices.Seven novel α-gliadin genes were cloned from Aegilops searsii,and the gene KC421089 were expressed by E.coli and highly purified proteins were obtained by cutting the gel slices.This study laid a good foundation for wheat quality improvement.

α-gliadin;Aegilops searsii;Sequence analysis;prokaryotic expression

S5

A

1000-2324(2015)03-0321-05

2014-04-12

2014-05-07

國(guó)家轉(zhuǎn)基因?qū)ｍ?xiàng)“優(yōu)質(zhì)轉(zhuǎn)基因小麥新品種培育(2011ZX08002004-003)

劉國(guó)娟(1987-),女,在讀碩士研究生,主要從事小麥及其近緣植物品質(zhì)相關(guān)基因克隆及功能驗(yàn)證.E-mail:liuguojuan0814@126.com

*通訊作者:Author for correspondence.E-mail:lkong@sdau.edu.cn