納米二氧化硅顆粒對HL－7702細胞黏附和遷移能力的影響

潘 濤，郭彩霞，金明華，劉曉梅，劉 穎，杜海英，孫志偉，4

（1.吉林大學公共衛生學院衛生毒理學教研室，吉林 長春 130021；2.西安醫學院公共衛生系，陜西 西安 710021；3.首都醫科大學公共衛生學院勞動衛生與環境衛生學系，北京 100069；4.首都醫科大學公共衛生學院衛生化學與毒理學系，北京 100069）

三維空間尺度中至少有一維處于納米尺度范圍的材料稱為納米材料，粒徑為1～100nm的納米顆粒、直徑為1～100nm的納米線和厚度為1～100nm的納米薄膜均是納米材料。近年來隨著納米技術的迅猛發展，工程化的納米二氧化硅材料已經被廣泛應用于生產生活的各個領域，人們通過呼吸、飲食、皮膚接觸等途徑接觸到納米二氧化硅材料的機會越來越多，其生物學安全性也受到廣泛的關注［1］。目前大部分體外研究更多地關注于由納米二氧化硅所引起的細胞毒性，然而在細胞的生長增殖未受到影響、細胞未發生死亡之前，某些特定的細胞功能 （如細胞的黏附、遷移和分化等）可能已發生改變，而常規的毒理學指標并不能有效地檢測出這些變化［2］。本實驗以人正常肝細胞株HL－7702為研究對象，探討納米二氧化硅顆粒對細胞黏附遷移的影響，旨在為更全面地評價納米二氧化硅顆粒的生物安全性，建立更完善的安全性評價體系提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 納米二氧化硅顆粒 （吉林大學化學院惠贈），RPMI－1640培養基 （Gibco公司，美國），胎牛血清 （天津灝洋生物公司），胰蛋白酶（DIFCO公司，美國），二甲基亞砜 （DMSO，沈陽市試劑五廠），麥氏膠 （Matrigel，Becton Dickinson公司，美國），其他試劑均為國產分析純。透射電子顯微鏡 （transmission electron microscope，TEM）（JEOL公司，日本），激光粒度分析儀 （Beckman Coulter公司，美國），多功能酶標儀 （MDC公司，美國），光學顯微鏡（Olympus公司，日本）。

1.2 納米二氧化硅顆粒的制備 在三頸瓶中加入100mL無水乙醇、4mL氨水、2mL水和5mL正硅酸乙酯，機械攪拌下于40℃水浴中反應12h，攪拌速度為150r·min－1；所得產物通過離心分離，離心轉速13000r·min－1，離心時間20min，所得粒子用超純水洗3次，并重新分散于100mL超純水中。

1.3 TEM觀察納米二氧化硅顆粒的形貌和粒徑分布 將納米二氧化硅顆粒分散于無血清的RPMI－1640培養液中，濃度為200mg·L－1，放置24h后，采用TEM觀察顆粒的形貌和分散性，Image－Pro－Plus軟件計算平均粒徑。

1.4 納米二氧化硅顆粒在分散介質中的粒度分布 將納米二氧化硅顆粒分別用含不同濃度血清 （0、1%、5%和10%）的RPMI－1640培養液稀釋，放置24h后，用動態光散射法檢測納米二氧化硅顆粒水合粒徑的大小，從而反映出納米二氧化硅顆粒在分散介質中的粒度分布。

1.5 人正常肝細胞株HL－7702的培養 人正常肝細胞系HL－7702購自中國科學院上海細胞生物研究所，細胞培養于含15%胎牛血清的RPMI－1640培養液中，置于37℃、5%CO2培養箱中傳代培養。

1.6 細胞黏附實驗 用無血清RPMI－1640培養液配制 Matrigel（1∶8稀釋）和牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA，10g·L－1），以50μL／孔均勻涂布于96孔板中，4℃過夜，BSA為對照基底。棄去各孔上清，加入含10g·L－1BSA的無血清培養液進行封閉，50μL／孔，37℃、30min。取對數生長期細胞，以1×105mL－1接種于6孔培養板中，每孔2mL，并設空白對照孔（不加細胞，其他步驟與陰性對照組相同）。于37℃、體積分數為5%CO2條件下培養24h后，加入分散于無血清RPMI－1640培養液中的納米二氧化硅顆粒，濃度分別為12.5、25.0、50.0和100.0mg·L－1，每孔2mL，對照組加無血清培養液2mL。培養24h后，溫PBS洗3次，胰酶消化收集細胞，調整細胞濃度至1×105mL－1，接種于已包被Matrigel膠和BSA的96孔板中，每孔200μL，每組3復孔，繼續培養2h后洗去未黏附細胞，按MTT比色法測定各孔細胞的吸光度 （A）值，根據A值計算相對黏附率。相對黏附率 （%）＝ （實驗組A值－空白組A值）／（對照組A值－空白組A值）×100。

1.7 劃痕修復實驗 用無血清RPMI－1640培養液配制Matrigel（1∶8稀釋），1mL／孔均勻涂布于6孔板中，4℃過夜。吸出殘液，每孔加入1mL含10g·L－1BSA的無血清培養液進行封閉，37℃、30min。取對數生長期細胞，接種于已包被Matrigel的6孔板中，每孔2mL，每組3復孔，于37℃、5%CO2條件下培養至細胞基本融合，用200μL滅菌吸頭在孔內劃痕，選取拍照點，做好標記，光鏡下拍照，測量出劃痕寬度作為0時的細胞劃痕寬度。棄掉培養液，PBS沖洗3遍，加入分散于無血清RPMI－1640培養液中的納米二氧化硅 顆 粒， 濃 度 分 別 為 12.5、25.0 和50.0mg·L－1，對照組加入無血清 RPMI－1640培養液，每孔2mL，培養24h后，在劃痕標記點處再次拍照，測量出劃痕寬度作為24h的細胞劃痕寬度。各標記點24h劃痕寬度減去0時劃痕寬度記為24h內細胞的遷移距離。損傷修復率 （%）＝遷移距離／0時細胞劃痕寬度×100。

1.8 TEM觀察細胞對納米二氧化硅顆粒的攝取及顆粒在細胞內的分布 取對數生長期細胞，以1×105mL－1接種于6孔培養板中，每孔2mL。于37℃、5%CO2條件下培養24h后，加入含濃度為25.0mg·L－1納米二氧化硅顆粒的無血清RPMI－1640培養液，每孔2mL，對照組加無血清培養液2mL。培養24h后，溫PBS洗3次，胰酶消化細胞，1000r·min－1離心10min，棄上清。細胞用含有2.5%戊二醛和4%多聚甲醛的0.1mol·L－1PBS固定3h，PBS洗后，放入2%瓊脂糖凝膠中，4%鋨酸后固定1h，蒸餾水洗后，以醋酸雙氧鈾染色1h，梯度乙醇 （體積分數分別為30%、60%、70%、90%和100%）脫水，環氧樹脂包埋，制作超薄切片，并以5%醋酸雙氧鈾和2%枸櫞酸鉛雙重染色后，TEM觀察。

1.9 統計學分析 采用SPSS 13.0統計軟件進行統計學分析。各組細胞相對黏附率和損傷修復率以表示，組間比較采用單因素方差分析。

2 結 果

2.1 納米二氧化硅顆粒的形貌 TEM結果顯示：納米二氧化硅呈圓形，顆粒大小均勻一致，分散性良好。應用Image Pro－Plus軟件計算顆粒平均粒徑為 （67.42±5.69）nm，屬于納米級顆粒。見圖1。

圖1 納米二氧化硅顆粒的透射電鏡圖像（×50000）Fig.1 TEM image of SiO2nanoparticles（×50000）

2.2 納米二氧化硅顆粒在含不同濃度血清的RPMI－1640培養液中的粒徑 應用動態光散射法檢測納米二氧化硅顆粒在含不同濃度血清的RPMI－1640培養液中的粒度分布，結果顯示：納米二氧化硅顆粒在無血清RPMI－1640培養液中水合粒徑為 （134.13±2.78）nm，而在含1%、5%和10%血清的RPMI－1640培養液中的水合粒徑明顯增大，分別為 （188.87±2.84）、 （170.23±2.00）和 （177.03±1.19）nm。

2.3 各組HL－7702細胞相對黏附率 經納米二氧化硅顆粒作用24h后，隨著作用濃度的增加，納米顆粒對細胞黏附能力的抑制程度增強，呈一定的濃度依賴效應。當 HL－7702細胞暴露于濃度為12.5mg·L－1的納米二氧化硅顆粒時，細胞的相對黏附率輕微下調，但與對照組比較差異無統計學意義 （P＞0.05），當納米二氧化硅濃度上升至25.0、50.0和100.0mg·L－1時，相對黏附率分別下降至78.04%、70.66%和62.30%，與對照組比較差異均有統計學意義 （P＜0.05）。見表1。

表1 納米二氧化硅顆粒作用24h后各組HL－7702細胞相對黏附率和損傷修復率Tab.1 Adhesion rates and healing rates of HL－7702cells after treated with SiO2nanoparticles for 24hin various groups （n＝3，，η／%）

表1 納米二氧化硅顆粒作用24h后各組HL－7702細胞相對黏附率和損傷修復率Tab.1 Adhesion rates and healing rates of HL－7702cells after treated with SiO2nanoparticles for 24hin various groups （n＝3，，η／%）

＊ P＜0.05 vs control group.

Group Adhesion rate Healingrate Control 100.00±13.58 49.55±6.73 SiO2nanoparticles（mg·L－1）12.5 97.18±8.73 47.81±6.5425.0 78.04±2.39＊ 34.25±4.47＊50.0 70.66±5.34＊ 23.03±4.27＊100.0 62.30±2.94＊ —

2.4 各組HL－7702細胞損傷修復率 采用劃痕修復實驗檢測納米二氧化硅顆粒對細胞遷移能力的影響，因在100mg·L－1的作用劑量下，細胞單層破壞嚴重，劃痕邊緣已分辨不清，故本實驗只選擇12.5、25.0 和 50.0mg·L－13 個 染 毒 組。當HL－7702細胞暴露于納米二氧化硅顆粒時，細胞的遷移能力可被抑制，并且隨著作用濃度的增加，納米顆粒對細胞遷移能力的抑制程度增強，呈濃度依賴效應。12.5mg·L－1納米二氧化硅顆粒暴露組HL－7702細胞的損傷修復率稍有下降，但與對照組比較差異無統計學意義 （P＞0.05）。25.0和50.0mg·L－1納米二氧化硅顆粒暴露組 HL－7702細胞的遷移能力明顯下降，損傷修復率分別下降至34.25%和23.03%，與對照組比較差異有統計學意義 （P＜0.05）。見表1。

2.5 HL－7702細胞對納米二氧化硅顆粒的攝取及顆粒在細胞內的分布 TEM結果顯示：對照組細胞呈橢圓形，表面布滿了許多微絨毛；細胞核較大，呈橢圓形，核仁一個，較大明顯；細胞質里可見粗面內質網，糖原顆粒等 （圖2A）。24h后，25.0mg·L－1納米二氧化硅顆粒暴露組 HL－7702細胞的亞結構未發生明顯的損傷性改變，但大量的納米顆粒已經被細胞攝取 （圖2B）；可見細胞膜凹陷，包裹吞噬納米顆粒的過程 （箭頭處）（圖2C）；顆粒以成簇的形式分布于內吞小泡中 （箭頭處）；亦可見顆粒散在分布于胞質中，周圍無膜結構包被（箭頭處）（圖2D）。

圖2 TEM觀察HL－7702細胞對納米二氧化硅顆粒的攝取及顆粒在細胞內的分布Fig.2 Cellular uptake of SiO2nanoparticles in HL－7702cells and its distribution in cells observed with TEM

3 討 論

顆粒物可通過調理作用被網狀內皮系統如肝臟和脾臟攝取。有研究［3］證實：納米二氧化硅顆粒易于在肝臟蓄積并引起病理性改變。本研究以人正常肝細胞株HL－7702為受試物，探究納米二氧化硅顆粒對其黏附和遷移能力的影響。

納米顆粒的粒徑、形貌和分散性等特征對其生物學效應及毒性有很大影響［4］，因此納米顆粒的表征是評價其生物學效應及毒性的重要參數［5］。本研究首先應用TEM和DLS對納米二氧化硅顆粒進行表征，TEM結果顯示：顆粒呈圓形，大小均一，分散性良好，其平均粒徑為67.42nm，屬納米級顆粒；DLS結果顯示：在含有不同濃度血清的培養液中，納米顆粒的水合粒徑均比在無血清培養液中的大，結果表明血清對于納米顆粒的水合粒徑有較大影響。為了避免血清對納米二氧化硅粒徑的影響，本研究選擇分散于無血清RPMI－1640培養液中的納米二氧化硅顆粒作為受試物。

細胞的黏附和遷移是動物細胞的基本的生命活動。細胞黏附通過一系列相關黏附分子的精密配合而完成，在細胞的存活、生長增殖、分化、組織的形成中均扮演重要角色［6］。細胞遷移也參與一系列生理和病理過程，在胚胎發育、傷口愈合、血管的再生和重塑及組織的形成等眾多生理過程中起關鍵作用，在炎癥反應和腫瘤轉移等病理過程中也扮演重要角色［7］。有學者［2］認為：納米顆粒能夠通過不同的途徑進入細胞或停留在細胞外基質中，除影響細胞的存活外，還可能會造成細胞的黏附遷移、分化等生理功能的改變，而這些細胞功能的改變卻不能通過經典常用的毒理學方法 （例如MTT和LDH活力實驗）來檢測。本研究采用細胞黏附實驗和劃痕修復對細胞的黏附遷移進行了檢測，結果表明：當HL－7702細胞暴露于納米二氧化硅顆粒時，顆粒能夠對細胞的黏附遷移產生抑制作用，并且隨著作用濃度的增加，納米顆粒對細胞黏附遷移能力的抑制程度增強，呈一定的濃度依賴效應。值得注意的是，根據本組前期的研究結果［8］，納米二氧化硅顆粒在25mg·L－1的作用劑量下并不能對HL－7702細胞產生毒性作用，但在此劑量下卻能明顯抑制HL－7702細胞的黏附和遷移能力，結果表明：納米二氧化硅顆粒對細胞黏附和遷移造成的影響發生在細胞存活受抑制、細胞膜受損之前。

為了避免因細胞膜損傷而致使納米二氧化硅顆粒被動地進入細胞，本研究選用無毒劑量（25.0mg·L－1）來觀察細胞對納米二氧化硅顆粒的攝取及顆粒在細胞內的分布，TEM結果表明：在25.0mg·L－1作用劑量下，細胞已能大量攝取納米二氧化硅顆粒，顆粒主要已呈簇的方式蓄積于內吞泡中，同時細胞膜凹陷、包裹吞噬納米顆粒的過程可被捕捉到，而散在分布、周圍無膜包被的顆粒可能由于內吞泡破裂進而釋放到胞質中［9］。研究［10］表明：細胞攝取納米顆粒最常見的方式是通過細胞內吞，此過程包括細胞膜凹陷，進而包裹吞噬納米顆粒。由此推測本研究中HL－7702細胞也是通過內吞的方式攝取納米二氧化硅顆粒。細胞骨架系統在細胞內吞過程中起重要作用，內吞的發生需要肌動蛋白細胞骨架的重組，在細胞通過內吞方式大量攝取納米顆粒的過程中，細胞骨架可能會受到損傷而導致骨架結構紊亂［11］，而細胞骨架系統與細胞黏附和遷移有密切關系。在本研究中，當無毒劑量 （25mg·L－1）的納米二氧化硅顆粒作用于細胞時，細胞的存活沒有受到影響、細胞膜未發生明顯的損傷［8］，然而大量的顆粒卻已進入細胞并且對細胞的黏附和遷移均產生了影響，其原因可能是當HL－7702細胞通過內吞方式大量攝取納米二氧化硅顆粒時，細胞骨架發生了損傷，進而導致細胞黏附和遷移能力下調。也有研究者［2］認為：納米二氧化硅顆粒可能通過影響FAK信號通路，抑制Src、PI3K和AKT激酶活性，從而抑制細胞的黏附和遷移，具體的作用機制還有待于進一步研究。

綜上所述，納米二氧化硅顆粒能夠抑制HL－7702細胞的黏附和遷移能力，并呈一定的濃度依賴效應。本研究為進一步探討納米二氧化硅顆粒的毒性提供了實驗基礎，為納米材料的安全性評價提供了新思路。

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