肝細胞生長因子和血管緊張素Ⅱ對腎小管上皮細胞轉分化的影響及其作用機制

王紅月，王 茉，張 晨，齊宏欣，遲寶榮

（1.吉林大學第一醫院腎內科，吉林 長春 130021；2.吉林大學藥學院再生醫學系，吉林 長春 130021；3.吉林大學第一醫院肝膽胰內科，吉林 長春 130021）

肝細胞生長因子 （hepatocyte growth factor，HGF）是一種重要的抗纖維化因子，具有抗肝纖維化作用［1］。近年來研究［2］顯示：HGF也有抗腎纖維化作用，但其抗腎間質纖維化的作用機制目前尚不完全清楚。近年來研究［3－4］表明：HGF可通過抗腎小管上皮－肌成纖維細胞轉分化 （tubular epithelial－myofibroblast transdifferentiation，TEMT）而防止腎臟纖維化，TEMT被認為是導致腎間質纖維化的重要原因。近期研究［5－7］發現：血管緊張素Ⅱ （angiotensinⅡ，AngⅡ）也是很強的致TEMT因子，且HGF與血管緊張素轉化酶抑制劑聯合有更好抗的TEMT作用，但關于HGF和AngⅡ對TEMT的影響及是否存在相關性尚無確切報道，本課題組主要針對HGF和AngⅡ與TEMT的關系進行深入研究。

1 材料與方法

1.1 細胞和主要試劑 人腎近曲小管上皮細胞（human kidney proximaltubular cells－2， HK－2）購自中國生命科學院上海細胞庫。RPMI－1640和胎牛血清 （美國 Gibco公司），CK－8試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒 （碧云天生物有限公司），α－平滑肌肌動蛋白 （α－SMA）抗體及二抗 （美國Santa Cruz），RT－PCR試劑盒 （日本 Takara公司）。

1.2 HK－2細胞培養HK－2細胞用含有10%RPMI－1640胎牛血清的培養液培養。在含10% 胎牛血清100U·mL－1青霉素和100mg·L－1鏈霉素的RPMI－1640培養基中傳代培養。將 HK－2細胞按1×106接種在75cm2Flask培養瓶中，培養條件為37℃、5%CO2，當貼壁細胞達80%～90%融合時用無血清培養基洗3次，進行傳代或種板，取Ⅳ期細胞進行實驗。

1.3 細胞分組及CCK8法檢測 以每孔1×103細胞接種于96孔板中，接種后6h加入刺激物，按加入刺激物的不同將HK－2細胞分對照組、AngⅡ組、HGF組和AngⅡ＋HGF組，每組3復孔。對照組只加HK－2細胞，HGF和AngⅡ組在細胞的基礎上分別加入8μg·L－1HGF 和1×10－6mol·L－1AngⅡ，AngⅡ＋HGF組在細胞基礎上同時加8μg·L－1HGF和1×10－6mol·L－1AngⅡ。24h后收集細胞，每孔加入10μL CCK8，37℃孵育1h后，檢測450nm處吸光度 （A）值。以A值表示細胞增殖活性。

1.4 RT－PCR法檢測 HK－2細胞中α－SMA mRNA表達水平 采用Trizol法提取總RNA，檢測mRNA濃度，逆轉錄合成cDNA。PCR擴增α－SMA基因，β－actin為內參。α－SMA，正義鏈5′－ACTGGGACGACTAGGAAAAAG－3′， 反 義 鏈5′－CATCTCCAGAGTCCAGCACA－3′。 β－actin，正 義 鏈 5′－ATCATGTTTGAGACCTTCAACAC－3′，反義鏈 5′－CATGGTGGTGCCGCCAGACAG－3′。PCR擴增體系：cDNA模板2μL，去離子水14.5μL，10× PCR 緩 沖 液 2.5 μL，dNTP（2.5mmol·L－1）2μL，MgCl2（25mmol·L－1）1.5μL，上游引物 （50μmol·L－1）1μL，下游引物 （50μmol·L－1）1μL，ExTaqDNA聚合酶（5U·μL－1）0.5μL，總體積25μL。PCR擴增反應條件：94℃、5min，94℃變性30s，58℃退火45s，72℃延伸1min，共30個循環；72℃延伸5min。PCR反應產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后，用Phoretix ID凝膠圖像分析軟件測定電泳條帶的灰度值，用內參校準，以α－SMA／β－actin灰度值比值表示α－SMA mRNA表達水平。

1.5 Western blotting法檢測 HK－2細胞中α－SMA蛋白表達水平 將細胞加入細胞裂解緩沖液，離心，提取總蛋白。取總蛋白50μg作SDS－PAGE電泳，凝膠濃度為10%，濃縮膠電壓110V，電泳30min，分離膠電壓100V，電泳90min。電泳結束后，用電轉印儀將蛋白轉移到PVDF膜上，時間60min，電流等于膠面積 （cm2）×0.55mA。PVDF膜用Blocking buffer（5% 脫脂奶粉）封閉4℃過夜。次晨，室溫1h，TBST［20mmol·L－1Tris－HCl（pH7.4），0.15mol·L－1NaCl，0.1%Tween］洗3次，加入α－SMA兔抗人多克隆抗體（1∶500）室溫孵育2h，TBST洗3次，加入辣根過氧化物酶交聯的羊抗兔IgG二抗 （1∶2000）1h，TBST洗3次，加入免疫印跡化學ECL發光試劑，暗室曝光顯影。用凝膠圖像分析系統掃描分析條帶的面積和灰度，蛋白區帶用積分灰度值表示，同時檢測β－actin的蛋白表達作為對照，其比值表示α－SMA蛋白表達水平。

1.6 統計學分析 采用SPSS 17.0統計軟件進行統計學分析。細胞增殖活性、α－SMA mRNA和蛋白表達水平均以表示，組間比較采用單因素方差分析。檢驗水準α＝0.05。

2 結 果

2.1 各組 HK－2細胞的增殖活性 與對照組（0.668±0.030）比 較，HGF 組細胞增 殖 活 性（0.737±0.051）升高 （P＜0.05），AngⅡ組和AngⅡ＋HGF組細胞增殖活性 （0.235±0.015和0.466±0.023）降低 （P＜0.05）；與 AngⅡ組比較，AngⅡ＋HGF組細胞增殖活性升高 （P＜0.05）。

2.2 各組 HK－2細胞中α－SMA mRNA 表達水平與對照組比較，HGF組和AngⅡ＋HGF組細胞中α－SMA mRNA表達水平降低 （P＜0.05或P＜0.01），AngⅡ組細胞中α－SMA mRNA表達水平升高 （P＜0.05）。與AngⅡ 組比較，AngⅡ＋HGF組細胞中α－SMA mRNA表達水平降低（P＜0.05）。見圖1和表1。

2.3 各組HK－2細胞中α－SMA蛋白表達水平 與對照組比較，HGF組細胞中α－SMA蛋白表達水平降低 （P＜0.05），AngⅡ組和 AngⅡ＋HGF組細胞α－SMA蛋白表達水平升高 （P＜0.05或P＜0.01）。與AngⅡ 組比較，AngⅡ＋HGF組細胞α－SMA蛋白表達水平降低 （P＜0.05）。見圖2和表1。

3 討 論

圖1 各組HK－2細胞中α－SMA mRNA表達電泳圖Fig.1 Electrophoregram ofα－SMA mRNA expressions in HK－2cells in various groups

表1 各組HK－2細胞中α－SMA mRNA和蛋白表達水平Tab.1 Expression levels ofα－SMA mRNA and protein in HK－2cells in various groups （n＝3，）

表1 各組HK－2細胞中α－SMA mRNA和蛋白表達水平Tab.1 Expression levels ofα－SMA mRNA and protein in HK－2cells in various groups （n＝3，）

＊ P＜0.05，＊＊ P＜0.01 vs control group；△P＜0.05 vs AngⅡgroup.

Group α－SMA mRNA Protein Control 210±30 199±25 AngⅡ 270±15＊ 796±55＊＊HGF 120±41＊＊ 119±11＊AngⅡ＋HGF 150±23＊△ 398±23＊△

圖2 各組HK－2細胞中α－SMA蛋白表達電泳圖Fig.2 Electrophoregram ofα－SMA protein expressions in HK－2cells in various groups

HGF是一種非組織特異性生長因子，是目前已知生物活性最廣泛的生長因子之一，其可以刺激多種上皮細胞和內皮細胞進行有絲分裂、運動以及小管形態的發生［8］。HGF作為一種有效的、拮抗纖維化形成的內源性因子，已經被用于治療腎纖維化的實驗及臨床研究中［9］。腎小管上皮細胞在某種刺激下激活，可表達α－SMA，顯示出肌成纖維細胞的形態，增殖能力加強，并產生大量間質基質成分，這一過程稱為TEMT。TEMT被認為是一個相互協作、調節精準的過程，包括4個重要步驟：①腎小管上皮細胞喪失細胞－細胞間連接，發生TEMT的早期，E－鈣黏蛋白的表達受抑；②α－SMA再表達和肌動蛋白重組，利于轉化細胞遷移、侵襲、甚至獲得收縮能力，可以作為TEMT的標志；③小管基底膜分裂破壞；④細胞遷移入侵能力增強。目前研究TEMT多以α－SMA為標志。近期的研究結果［4］提示：腎間質纖維化很大程度上是由于TEMT引起的，因此研究能夠抑制TEMT的物質對防治腎間質纖維化至關重要。國內外的研究［10］及本課題組研究結果［3］顯示：HGF有逆轉TEMT的作用，但關于其具體機制尚在探討中，多數學者認為其主要是通過對TGF－β1的抑制而實現的，目前有些研究［7，11－12］已顯示：HGF與AngⅡ的關系不容忽視。AngⅡ也是很強的致TEMT因子，前期的實驗研究證實HGF與血管緊張素轉換酶抑制劑鹽酸貝納普利 （洛汀新）合用較單獨應用HGF或洛汀新可更進一步減輕腎間質纖維化，二者有協同作用。而洛汀新的腎臟保護作用主要是由對AngⅡ的抑制作用而實現的，提示HGF亦可抑制AngⅡ，故兩者合用作用增強，或通過其他途徑放大了洛汀新抑制AngⅡ的作用。

本研究結果顯示：與對照組比較，HGF組α－SMA mRNA和蛋白表達水平降低，促進腎小管上皮細胞增生，而AngⅡ組α－SMA mRNA和蛋白的表達增多，抑制腎小管上皮細胞增生，說明HGF不但可以促進腎小管上皮細胞增生，而且可以從基因及蛋白水平上抑制腎小管上皮細胞α－SMA的表達，即可抑制TEMT；而AngⅡ可抑制細胞增生，促進α－SMA的表達，促進TEMT，兩者作用相反。與單獨應用AngⅡ對比，同時加入HGF和AngⅡ時，腎小管上皮細胞增生明顯，α－SMA的 mRNA及蛋白表達減少，即 HGF對AngⅡ抑制細胞增生及促進TEMT方面有逆轉作用。本研究結果進一步擴充了HGF的作用機制，但在信號轉導方面需要深入探討。

［1］陳二林，陳 鐘.肝細胞生長因子與肝臟疾病的研究進展 ［J］.南通大學學報：醫學版，2013，33 （4）：310－314.

［2］Wang HY，Yang LZ，Cui MJ，et al.Pathological changes，TGF－β1expression，and the effects of hepatocyte growth factor in 5／6nephrectomized rats ［J］.Ren Fail，2014，36 （3）：393－399.

［3］Wang HY，Yang LZ，Cui MJ，et al.Hepatocyte growth factor－induced amelioration in chronic renal failure is associated with reduced expression ofα－smooth muscle actin ［J］.Renal Fail，2012，34 （7）：862－870.

［4］Liu Y.New insight into epithelial－mesenchymal transition in kidney fibrosis［J］.J Am Soc Nephrol，2010，21 （2）：212－222.

［5］Yan Z，Yao F，Zhang LP，et al.Effects of irbesartan on expression of glycogen synthase kinase－3βin tubular epithelialmesenchymal transition induced by high glucose ［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25 （2）：225－229.

［6］Chen J，Chen JK，Harris RC.Angiotensin Ⅱ induces epithelial－to－mesenchymal in renal epithelial cells through reactive oxygen species／Src／caveolin－mediated activation of an epidermal growth factor receptor－tracellular signal－regulated kinase signaling pathway ［J］.Mol Cell Biol，2012，32 （5）：981－991.

［7］Wang HY，Wang YJ，Cui MJ，et al.Hepatocyte growth factor－induced amelioration in renal interstitial fibrosis is associated with reduced expression ofα－smooth muscle actin and transforming growth factor－β1 ［J］.Indian Biochem Biophys，2011，48 （5）：308－315.

［8］Forte G，Minieri M，Cossa P，et al.Hepatocyte growth factor effects on mesenchymal stem cells：proliferation，migration，and differention ［J］.Stem cells，2006，24 （1）：23－33.

［9］Nakamura T，Sakai K，Nakamura T，et al.Hepatocyte growth factor twenty years on：Much more than a growth factor［J］.J Gastroenterol Hepatol，2011，26 （Suppl 1）：188－202.

［10］崔清波，郭曉輝，楊書龍.HGF對TGF－β1誘導的α－SMA陽性肌腱成纖維細胞的影響 ［J］.哈爾濱醫科大學學報，2014，48 （1）：9－12.

［11］Finckenberg P，Eriksson O，Baumann M，et al.Caloric restriction ameliorates angiotensin Ⅱ－induced mitochondrial remodeling and cardiac hypertrophy ［J］. Hypertension，2012，59 （1）：76－84.

［12］Liu Y，Shi QF，Qi M，et al.Interruption of hepatocyte growth factor signaling augmented oridonin－induced death in human non－small cell lung cancer A549cells via c－Met－nuclear factor－κB－cyclooxygenase－2 and c－Met－Bcl－2－caspase－3 pathways ［J］.Biol Pham Bull，2012，35 （7）：1150－1158.