力竭離心運動對發(fā)育期大鼠骨骼肌MyoD、myogenin表達的影響

廖艷萍，湯長發(fā)

（1.湖南文理學(xué)院 芙蓉學(xué)院，湖南 常德 415000；2.湖南師范大學(xué) 體育學(xué)院，湖南 長沙 410012）

力竭離心運動對發(fā)育期大鼠骨骼肌MyoD、myogenin表達的影響

廖艷萍1，湯長發(fā)2

（1.湖南文理學(xué)院 芙蓉學(xué)院，湖南 常德 415000；2.湖南師范大學(xué) 體育學(xué)院，湖南 長沙 410012）

目的：研究不同時間力竭離心運動后發(fā)育期大鼠骨骼肌成肌調(diào)節(jié)因子MyoD、myogenin的表達情況，探討力竭離心運動對發(fā)育期大鼠骨骼肌纖維類型轉(zhuǎn)化的影響機制.方法：健康4周齡雄性SD大鼠24只，隨機分為安靜對照組（NC），3周訓(xùn)練組（T3），6周訓(xùn)練組（T6），每組8只.采用RT-PCR檢測MyoD、myogenin的表達.結(jié)果：力竭離心運動后，發(fā)育期大鼠比目魚肌與股四頭肌中MyoD、myogenin均有表達；運動3W后，比目魚肌中MyoD表達上調(diào)（P﹤0.05），myogenin表達下調(diào)（P﹤0.05）；運動6周后，與對照組相比，比目魚肌中MyoD、myogenin的表達有些微變化，但不具統(tǒng)計意義.力竭離心運動不同時間后股四頭肌中MyoD表達均明顯上調(diào)（P﹤0.05）且與運動時間成正比；myogenin表達基本沒有變化.結(jié)論：力竭離心運動能影響發(fā)育期大鼠骨骼肌中MyoD、myogenin的表達，并在不同部位影響不一致，且為非線性變化，可能受生長發(fā)育階段的影響且與運動時間有關(guān).

力竭離心運動；MyoD；myogenin；發(fā)育期

MyoD、myogenin是重要的成肌調(diào)節(jié)因子，其家族成員共有4個，除上述二者之外，還有myf-5及MFR4.該家族成員是唯一在骨骼肌表達的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白因子，MyoD和myogenin在肌細胞分化中可以調(diào)節(jié)DNA的順序和轉(zhuǎn)錄；MyoD不僅能使未分化的細胞轉(zhuǎn)化成為肌細胞，還可以將已經(jīng)分化的細胞（如脂肪細胞、成纖維細胞）向肌纖維方向分化，形成多核肌纖維.且有研究證明，MyoD、myogenin在骨骼肌在損傷修復(fù)、再生中均起著重要作用.本研究著重觀察不同時間力竭離心運動后發(fā)育期大鼠骨骼肌中MyoD、myogenin的表達情況，并試圖探討MyoD、myogenin與骨骼肌纖維類型轉(zhuǎn)化的相關(guān)聯(lián)系.

1 材料與方法

1.1 動物分組及運動方案

健康4周齡雄性SD大鼠（購于湖南農(nóng)大動物中心）24只，體重約80～110克，隨機分為安靜對照組（NC），運動組（DT）包括3周訓(xùn)練組（T3），6周訓(xùn)練組（T6），每組8只.采用Bedford的運動負荷方案，跑臺坡度為-10°，速度26.8m/min，訓(xùn)練時間為30分鐘,每周訓(xùn)練5天，休息2天.為保證運動強度與運動量，訓(xùn)練時采用毛刷刺激大鼠尾部，必要時采用聲刺激和電刺激.

1.2 取材

對照組和運動組大鼠分別于安靜狀態(tài)和運動后24小時腹腔麻醉后斷頭處死，取左側(cè)后肢比目魚肌和股四頭肌，用錫紙包埋后迅速投入液氮，最后置于-80℃超低溫冰箱保存.

1.3 指標檢測

取發(fā)育期大鼠比目魚肌和股四頭肌樣品，采用RT-PCR對MyoD、myogenin蛋白含量進行檢測，檢測步驟嚴格按照要求進行.RT試劑盒購于Fermentas life sciences(ma-de in EU),PCR引物購于上海捷瑞生物工程有限公司，Trizol購于北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒購于Tiangen Biotech(Beijing)CO.,LTD.每組DNA樣品加入到一塊（11孔）支持介質(zhì)（瓊脂糖凝膠）的樣品孔中，檢測其蛋白質(zhì)含量，取其均值，進行組間比較.

2 結(jié)果

2.1 比目魚肌MyoD、myogenin mRNA變化情況

對照組和運動組發(fā)育期大鼠比目魚肌MyoD、myogenin mRNA表達情況為：與NC組比較，T3組MyoDmRNA升高（P＜0.05），myogenin mRNA下降（P＜0.05）；其他組間均未見顯著性差異（P＞0.05）.具體情況見表1：

表1 比目魚肌MyoD、myogenin mRNA含量比較

2.2 股四頭肌MyoD、myogenin mRNA變化情況

對照組與發(fā)育期大鼠運動組股四頭肌MyoD、myogenin mRNA情況如表2.與NC組比較，運動3W、6W后DT組MyoDmRNA升高（P＜0.05）；且DT組MyoD mRNA存在時間段上的差異，且差異具有顯著性（P＜0.05），其它組間均未見顯著性差異（P＞0.05）.各組myogenin mRNA表達只有些微變化，不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）.

表2 股四頭肌MyoD、myogenin mRNA含量比較

3 討論

3.1 運動訓(xùn)練對大鼠骨骼肌MyoD、myogenin表達的影響

3.1.1 運動訓(xùn)練對成年大鼠骨骼肌MyoD、myogenin表達的影響

有研究者認為運動訓(xùn)練對MyoD和myogenin在骨骼肌中的表達有一定的影響，且研究表明在成熟的骨骼肌中Myogenin mRNA主要在慢肌纖維中表達，MyoD mRNA主要在快肌纖維中表達.為了解耐力訓(xùn)練對生肌調(diào)節(jié)因子myogenin和MyoD表達的影響，蘇艷紅、王瑞元[1]對SD大鼠進行耐力訓(xùn)練，RT-PCR測定大鼠脛骨前肌淺層中myogenin和MyoD mRNA的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，耐力訓(xùn)練使myogenin和MyoD mRNA均顯著下降.史冀鵬[2]的研究證明：四周的離心運動能上調(diào)Myf5與myogenin蛋白表達，下調(diào)MyoD與MRF4蛋白表達.潘同斌、毛姍姍[3]研究發(fā)現(xiàn)，慢性低氧以及跑臺訓(xùn)練能使myogenin和MyoD基因表達明顯升高（P＜0.01），該研究結(jié)果是myogenin和MyoD的表達同步轉(zhuǎn)化.

3.1.2 運動訓(xùn)練對發(fā)育期大鼠骨骼肌MyoD、myogenin表達的影響

實驗動物SD大鼠的生長發(fā)育有其階段性特點，3周齡之內(nèi)為哺乳期，4周齡離乳后進入生長期（4至13周齡），且與人類青春期生長發(fā)育相似.查閱文獻資料庫，本研究團隊發(fā)現(xiàn)：研究各種運動對發(fā)育期大鼠骨骼肌影響的文獻并不多見，尤其是運動對大鼠骨骼肌成肌因子影響的研究基本處于空白，本實驗著重研究該特殊時期力竭離心運動對大鼠骨骼肌成肌因子的影響.通過對發(fā)育期大鼠進行力竭離心運動的訓(xùn)練，發(fā)現(xiàn)發(fā)育期大鼠骨骼肌MyoD表達的變化較為明顯，無論是在比目魚肌還是在股四頭肌中，該蛋白質(zhì)表達的變化均較為活躍，該現(xiàn)象表明力竭離心運動能夠引起MyoD的顯著變化，根據(jù)其功能，該現(xiàn)象可能暗示兩個結(jié)果：第一，骨骼肌快肌纖維數(shù)量增多或者說快肌纖維面積增大；第二，此時骨骼肌存在損傷，且處在損傷、修復(fù)、再生的高峰期.根據(jù)表1，比目魚肌中MyoD的表達出現(xiàn)顯著變化是在訓(xùn)練3W時，后期表達并不明顯，是否意味著訓(xùn)練適應(yīng)后損傷程度有所降低，進而MyoD的表達有所下調(diào)；此階段還有myogenin表達的同步轉(zhuǎn)化，提示myogenin除了參與骨骼肌修復(fù)外，骨骼肌纖維類型比例也可能發(fā)生變化.而在股四頭肌中，MyoD的表達在各時段都出現(xiàn)了顯著變化，前期變化原因極有可能與比目魚肌中MyoD變化的原因一致，但后期的變化可能單純的意味著力竭離心運動能夠引起股四頭肌中快肌纖維數(shù)目的增加或面積的增大.

3.2 MyoD、myogenin表達與骨骼肌纖維類型轉(zhuǎn)化的相關(guān)聯(lián)系

骨骼肌纖維具有很大的可塑性，根據(jù)它特有的肌球蛋白重鏈（MHC）亞型，可將骨骼肌纖維進行分類.經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)：哺乳動物骨骼肌纖維肌球蛋白亞型表達共有11種之多，但多數(shù)成體哺乳動物的骨骼肌肌球蛋白重鏈亞型主要為Ⅰ型、Ⅱa型、Ⅱd/x型、Ⅱb型，而其它的MHC亞型異構(gòu)體只在特異的肌肉中表達，且這四種亞型之間存在相互平行轉(zhuǎn)化的關(guān)系，即：Ⅰ?Ⅱb?Ⅱd/x?Ⅱa.但骨骼肌纖維類型相互轉(zhuǎn)化的具體機制還不甚清楚，現(xiàn)有研究只是發(fā)現(xiàn)骨骼肌纖維類型轉(zhuǎn)化受多種信號通道調(diào)控，其中就包括MRFs家族，該家族中MyoD、myogenin的作用尤為明顯.在成熟的骨骼肌中，MyoD是存在于快肌纖維中重要的轉(zhuǎn)錄因子，它的表達通常與快肌纖維數(shù)目或面積成正比，myogenin則在慢肌纖維中存在較多.MyoD、myogenin的轉(zhuǎn)錄活性受許多生長因子和癌基因的負向調(diào)節(jié)，例如：成纖維生長因子受體、DNA抑制劑等.Melissa.L.ehlers[4]通過活體檢測就發(fā)現(xiàn)MyoD受NFATc1的影響，該調(diào)節(jié)蛋白能抑制其活性，促使快肌纖維向慢肌纖維轉(zhuǎn)化.該研究還證明NFATc1能夠控制骨骼肌纖維類型的組成，而且通過持續(xù)的有氧運動能夠改變其含量，進而增加慢肌纖維的比例.

4 展望

肌細胞生長和調(diào)控因子MyoD、myogenin是重要的功能因子.MyoD能調(diào)節(jié)初期細胞的增殖過程，使得未分化的干細胞向成肌細胞分化；myogenin則能調(diào)節(jié)末期細胞的分化過程，使得成肌細胞最終分化成為多核肌細胞.而在成熟的骨骼肌中，MyoD多在快肌纖維中表達，myogenin多在慢肌纖維中表達.本研究表明：力竭離心運動能夠使發(fā)育期大鼠骨骼肌MyoD、myogenin的表達發(fā)生變化，但受訓(xùn)練時間差異的影響，并未呈現(xiàn)線性結(jié)果，二者的表達差異在訓(xùn)練3W時較為顯著.根據(jù)實驗結(jié)果以及MyoD、myogenin的功能，同時結(jié)合骨骼肌的生理特性，我們大膽推測力竭離心運動能夠引起發(fā)育期大鼠骨骼肌纖維類型發(fā)生變化，使得快肌纖維比例上調(diào)，但其具體機制還不清楚，有待于進一步研究.

〔1〕蘇艷紅,王瑞元，等.耐力訓(xùn)練對肌球蛋白重鏈的影響及MyoD、myogenin的調(diào)控作用 [J].體育學(xué)刊,2007,14(2): 48-52.

〔2〕史冀鵬.離心運動對骨骼肌生肌調(diào)節(jié)因子的影響及針刺干預(yù)研究[D].北京體育大學(xué),2011.

〔3〕潘同斌,毛珊珊.慢性低氧及跑臺訓(xùn)練對大鼠骨骼肌成肌調(diào)節(jié)因子MyoD和myogenin基因表達的影響[J].北京體育大學(xué)學(xué)報,2007,30(9):1209-1211.

〔4〕Melissa.L.ehlers,Barbara.Celona,et al.NFATc1 controls skeletal muscle fiber ty-pe and is a negative regulator of MyoD activity[J].Cell Rep.2014,8(6):1639–1648.

〔5〕Alex Hennebry,Carole Berry,et al.Myostatin regulates fiber-type composition of skeletal muscle by regulating MEF2 and MyoD gene expression[J].Cell Phy-siology.2009,296(3):525-534.

〔6〕廖艷萍.大強度離心運動對發(fā)育期大鼠骨骼肌纖維類型及MyoD、myogenin表達的影響[D].湖南師范大學(xué),2009.

G804.7

A

1673-260X（2015）12-0148-02

湖南省教育廳科研項目（13C636）