渤海海域褐潮期微型浮游生物多樣性的初步研究*

于 杰，張玲玲，孫 妍，張 璐，焦文倩，竇懷乾，郭浩冰，包振民

（中國海洋大學海洋生物遺傳育種教育部重點實驗室，山東 青島 266003）

近年來，伴隨著經濟的快速發展，不規范的海洋排污、過度的水產養殖現象日益嚴重，致使近海水體富營養化不斷提高，有害藻潮的發生頻率顯著增加［1］。有害藻潮發生過程中，有害藻大量聚集，使得水體嚴重缺氧、水下采光不足，導致生物大量死亡，破壞海洋生態系統；產生的毒素不僅能殺死魚、貝類等海洋生物，還可直接或間接危害人類健康；此外，有害藻潮導致的水體透明度降低、變色、異味，嚴重阻礙旅游、娛樂行業的發展［2］。據國家海洋局發布的海洋災害公報，僅2008—2012年中國有害藻潮造成的漁業海水養殖業直接經濟損失累計達22.91億元。

2009 年以來，每年6～7月左右在河北省渤海海域相繼爆發褐潮。褐潮爆發時，水體呈褐色，褐潮優勢藻濃度高達109個/L，嚴重影響海灣扇貝的進食，導致扇貝滯長甚至死亡［3］。據國家海洋局發布的海洋災害公報，僅2010年該褐潮就給河北省造成了2.05億元的經濟損失。褐潮藻個體微小（約2μm）［3］，采用傳統的形態學觀察難以準確鑒定。相比之下，分子生物學方法具有簡單、快速、準確等特點，無疑成為褐潮檢測的有效手段。

18SrDNA結構和功能保守，區分力可達到種屬水平，常用于物種鑒定和系統發生分析［4］。自2001年以來，它就被廣泛應用于微型和超微型浮游生物的多樣性研究，為海洋浮游生物組成結構分析開辟了廣闊的道路［5－10］。18SrDNA含有保守區和可變區，保守序列區反映了生物種間的親緣關系，而可變序列區則能體現物種間的差異。真核生物的18SrDNA含有8個可變區，其中可變區V9序列長度短、變異大，在分類學研究中具有較好的應用前景［11－13］。本研究擬通過對2011年7月山海關、新開口、樂亭3個渤海海域褐潮樣品中微型浮游生物的18SrDNA可變區V9進行PCR擴增、測序、比對，比較不同海域微型浮游生物的結構組成，探討褐潮的優勢種，為褐潮的研究提供有力的參考。

1. 材料與方法

1.1 樣品的采集

褐潮樣品于2011年7月5、6日采自山海關海域的站位1（119°49′1.90″E，39°57′1.80″N）、新開口海域的站位2（119°25′49.00″E，39°34′16.00″N）以及樂亭海域的站位3（119°20′51.50″E，39°26′11.00″N）（見圖1）。利用采水器于上述3海域采集500mL表層新鮮海水，用20μm微孔濾膜過濾，去除大于20μm的浮游生物后，用2μm微孔濾膜過濾收集微型浮游生物，液氮速凍后，保存于－80°C。

1.2 總DNA的提取

將2μm濾膜（約1/2張）置于1.5mL離心管中，加入600μL CTAB 緩沖液（2%CTAB；100mmol/L Tris-Cl pH＝8.0；1.4mmol/L NaCl；10mmol/L EDTA）和12μLβ－巰基乙醇，65℃水浴1h。棄濾膜，酚酚氯仿抽提2次，加入2倍體積無水乙醇沉淀DNA，70%乙醇清洗沉淀，加入200ng RNaseA 37℃處理30min后，得到基因組DNA，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并測定DNA濃度，4℃冰箱保存備用。

圖1 采樣地點分布示意圖Fig.1 Illustration of the sampling stations

1.3 18SrDNA可變區V9的擴增及產物3′末端加A

利用18SrDNA V9區通用引物 V9F（5′-CCCTGCCHTTTGTACACAC-3′）和 V9R（5′-CCTTCYGCAGGTTCACCTAC-3′）［11］，擴增可變區 V9：反應體系為40μL，包括1×Phusion HF Buffer、0.2mmol/L dNTPs、0.5 μmol/L 引 物 V9F、0.5 μmol/L 引 物V9R、1.25ng/μL基因組 DNA、0.8UPhusion超保真DNA聚合酶（NEB）。PCR反應條件：98℃預變性30s；98℃變性10s、55℃退火30s、72℃延伸20s，20個循環；最后72℃延伸10min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物后，進行PCR產物純化，測定產物濃度，進行3′末端加A：反應體系32μL，包括純化后的PCR產物500ng、2UTaq酶、0.2mmol/L dATP、1×Taq Buffer、1.4mmol/L MgCl2，72℃反應20min后進行產物純化備用。

1.4 克隆、測序與序列分析

將上述純化產物按照pMD18-T Vector kit（Takara）說明書步驟連接到T載體上。將連接產物與DH5α感受態細胞于1.5mL離心管中混勻，42℃熱激90s，快速移至冰上。3～5min后，4℃2 000r/min離心2～3min。棄掉上清，向沉淀中加入500μL LB培養基，37℃培養20～30min后，涂布于加有氨芐青霉素的平板上，倒置培養過夜。每個站位用菌落PCR技術挑選50個陽性克隆，送上海生工生物工程公司進行Sanger測序。將測得的序列去掉兩端的V9引物序列，利用BLASTN與NCBI數據庫進行比對，查找同源序列。

1.5 指數的計算

本研究對三站位的真核微型浮游生物多樣性指數（香農－維納指數Shannon-Wiener index，H）、豐富度指數（Margalef index，D）及褐潮優勢藻優勢度指數（Berger-Parker優勢度指數，Y）分析，各指數的計算公式如下：

其中：pi為第i個OTU所占序列的比例；S為OTU個數；Nmax為優勢OTU的序列數；N為總序列數。

2 結果

2.1 各站位克隆文庫多樣性比較

BLASTN比對結果顯示，山海關、新開口和樂亭測得的序列中，能比對到屬及屬以下的序列數分別為44、29和36條（見表1）。

表1 18SrDNA V9可變區BLASTN比對結果Table 1 BLASTN results of the 18SrDNA V9hypervariable region amplicons

續表1

分析發現，山海關僅含有4門7屬7種生物，而新開口和樂亭分別含有8門16屬18種和9門20屬20種生物。新開口和樂亭2站位的香農－維納指數和Margalef豐富度指數數值均相近，且大大高于山海關（見表2），說明新開口和樂亭的物種多樣性及豐富度均高于山海關。

其中浮生藻（Pelagophyceae）、硅藻（Bacillariophyta）和綠藻（Chlorophyta）為3個站位所共有；其中浮生藻全部比對到抑食金球藻（Aureococcusanophagefferens），分別占山海關、新開口和樂亭測序總數的74%、12%和6%；硅藻占山海關、新開口和樂亭測序數的4%、8%和24%；綠藻分別占4%、4%和14%。甲藻（Dinophyceae）為山海關和新開口2站位所共有，分別占2個站位測序數的6%和12%，而纖毛蟲（Ciliophora）、絲足蟲（Cercozoa）和隱藻（Cryptophyta）存在于新開口和樂亭，分別占新開口和樂亭測序總數的12%和16%、4%和4%、4%和4%。定鞭藻（Haptophyceae）為新開口所特有，占新開口測序數的2%，金藻（Chrysophyceae）和甲殼類（Crustacea）為樂亭所特有，各占2%。各站位微型浮游生物的多樣性分布見圖2。

表2 各站位Shannon-Wiener指數和Margalef指數Table 2 Shannon-Wiener index and Margalef index at each station

圖2 3個站位中微型浮游生物的多樣性分析Fig.2 Diversity of nanoplankton at each station

2.2 各站位含量較高物種的比較

圖3 各站位中含量較高的物種分布圖Fig.3 Distribution of abundant species at each station

比較各站位中序列數較多（≥2）的物種（見圖3），結果顯示，抑食金球藻在3個站位含量都很高，山海關為37條，新開口為6條，樂亭為3條；多形微眼藻（Minutocelluspolymorphus）在樂亭和新開口中含量較高，樂亭為9條，新開口為2條；此外，有一些物種是不同站位所特有的，比如：山海關海域有甲藻Peridiniuminconspicuum，新開口海域有纖毛蟲Pelagostrobilidiumminutum和Strombidinopsisacuminata、甲藻Dinophyceaesp.和隱藻Teleaulaxacuta，樂亭海域有纖毛蟲Strombidiumsp.、絲足蟲Cercomonasvolcana、硅藻Cyclotellachoctawhatcheeana和綠藻Nannochlorissp.。另外，在新開口海域發現了1種豐度較高的未知物種，該序列是新開口海域中含量最高的，占新開口測序總數的16%。

2.3 2種褐潮優勢藻在各站位中的分布情況

進一步分析2種褐潮優勢藻，即抑食金球藻和多形微眼藻在3個站位中的分布情況（見圖4），結果顯示，山海關和新開口中抑食金球藻的優勢度均高于多形微眼藻，前者在山海關和新開口海域優勢度分別為0.74和0.12，而后者僅為0.02和0.04；樂亭的優勢藻為多形微眼藻，優勢度達到0.18，高于抑食金球藻（0.06）。

圖4 2種褐潮優勢藻在各站位的優勢度分布情況Fig.4 Dominance degree of the two dominant species at each station

3 討論

渤海海域褐潮優勢藻為圓球體，直徑約2μm，屬于微型浮游生物。為更全面地研究褐潮爆發期微型浮游生物的組成結構，本次研究選取了渤海海域自山海關至樂亭長達38海里海域的3個站位，對其微型浮游生物的18SrDNA可變區V9進行了克隆測序。結果顯示，3個站位都含有較高豐度的抑食金球藻，同時，該藻呈金光色球形或亞球形，直徑2μm左右［13］，與渤海褐潮優勢藻的形態相符。根據以上分析，作者推測抑食金球藻很可能為渤海海域褐潮的主要優勢藻，這與張清春等人對秦皇島洋河口海域（119°26′34.68″E，39°45′30.00″N）褐潮藻的研究結果一致［3］。

迄今為止，抑食金球藻已經在多個國家引發了褐潮。1985年夏季，抑食金球藻首次在美國長島沿海、羅德島、納拉干塞特灣、班梅蓋特灣新澤西州等海域引發大面積的褐潮，最高濃度達（1～3）×109個/L［14－16］。褐潮爆發期間，海灣扇貝、硬殼蛤等養殖貝類的生長受到嚴重阻礙，給當地的生態環境和貝類養殖業帶來了嚴重的損失［15，17－18］。此外，該 藻 于 1997 年 在 南 非 薩 爾 達尼亞灣也引發了褐潮，使得當地的生態環境和漁業養殖業損失嚴重［19］。自2009年起，我國渤海海域每年夏季都會爆發褐潮，導致養殖區內海灣扇貝大量死亡，使中國成為第三個遭到褐潮影響的國家。抑食金球藻之所以能在弱光、高有機物和高金屬離子的褐潮環境中占據優勢，主要是由于其基因組中具有較多的涉及捕光、有機碳、氮利用和金屬酶的編碼基因，這使其比其它浮游植物更適應褐潮的環境［20］。

本研究還發現了除抑食金球藻外的另一種優勢藻－多形微眼藻，該藻屬硅藻門、微眼藻屬，長2.1～3.4 μm，細胞呈圓形、近圓形或長橢圓形。研究顯示，該藻在3個站位均可檢測到，在樂亭海域的豐度最高。褐潮爆發期間多形微眼藻豐度較高這一現象，在1985年美國納拉干塞特灣褐潮中也有報道［21］。根據國外學者的研究，褐潮爆發后，除抑食金球藻外，還伴隨中肋骨條藻（Skeletonemacostatum）、假微型海鏈藻（Thalassiosirapseudonana）和多形微眼藻的增長［21］。但與美國1985年褐潮不同的是，本研究只檢測到了多形微眼藻，并未發現中肋骨條藻和假微型海鏈藻。此外，Christopher等［22］的研究也發現，多形微眼藻能降低海灣扇貝幼蟲的生長率，與渤海海域褐潮期觀察到的海灣扇貝幼蟲的滯長現象一致。

綜合以上研究結果，抑食金球藻和多形微眼藻在3個褐潮海域均有分布，且二者在光鏡下大小相近，形態相似，都能抑制海灣扇貝的生長，與實際觀察的渤海褐潮現象相符；除此之外，國外學者研究發現二者在褐潮爆發時可大量共存［21］。由此推測，渤海海域褐潮可能是由抑食金球藻和多形微眼藻共同作用而成。2種優勢藻在3個站位的分布情況不同，抑食金球藻在山海關海域的含量最高，其次是新開口，再次是樂亭，而多形微眼藻則相反，這可能與2種藻的生長習性有關，其機制還有待于進一步研究。

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