殼聚糖基水凝膠對腫瘤在體內外生長的影響研究*

王 慧，宋福來，劉萬順，韓寶芹

（中國海洋大學海洋生命學院，山東 青島266003）

殼聚糖是一種天然高分子聚合物，其來源廣泛、儲量豐富，無毒，具有良好的生物相容性、生物可降解性和吸附性，被用做多種生物功能材料［1］。目前，殼聚糖及其衍生物的輔助免疫、抑制癌細胞及腫瘤生長等作用和作為抗腫瘤藥物轉運載體的研究正日益受到國內、外學者的廣泛關注［2］。但殼聚糖在水中的溶解性差，且在酸溶液中不穩定，這在很大程度上限制了它的應用［3］。

水凝膠是能夠吸收大量水并急速增大體積的高溶脹親水性聚合物［4］。作為一種新型生物材料，可用于提高局部藥物濃度、緩釋控釋以及原位植入，已廣泛應用于藥物載體和組織工程學研究［5］。目前關于水凝膠的抗腫瘤應用還少有報道。殼聚糖基水凝膠可以改善殼聚糖在液體環境中的穩定性，并且表現出對溫度或pH的敏感性［6］。實驗所用殼聚糖基水凝膠（水凝膠）是一種溫敏性水凝膠，37℃成膠時間最短，可在體內原位成膠［7］。本研究從體內、體外兩方面研究水凝膠對腫瘤生長的影響作用，為殼聚糖基水凝膠作為抗腫瘤醫用材料的臨床應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

殼聚糖基水凝膠（水凝膠）由青島博益特公司提供。RPMI1640培養基（Gibco），新生牛血清（Hyclone），胰蛋白酶和 MTT（Sigma），小鼠白介素-2（IL-2）Elisa試劑盒、小鼠腫瘤壞死因子－α（TNF-α）Elisa試劑盒及小鼠干擾素－γ（IFN-γ）Elisa試劑盒（南京建成生物工程研究所），其他試劑均為國產分析純。

倒置顯微鏡（日本 Olympus），超凈工作臺、BB16FCO2培養箱（上海力申科學儀器有限公司），全波長酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific）。

1.2 實驗材料

人宮頸癌細胞Hela及人胃癌細胞SGC-7901由中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所提供；小鼠腹水瘤S180細胞購自中國海洋大學藥物研究所。昆明種小鼠30只，雌雄各半，體重18～22g，購自青島市藥檢所。

1.3 實驗方法

1.3.1 水凝膠溶液制備 無菌條件下，以無血清的RPMI1640培養基為介質，加入一定質量的水凝膠，分別配置 成 0.001、0.002 5、0.005、0.01、0.025、0.05、0.1、0.25g·mL－1的水凝膠溶液，于37℃，180r·min－1搖床震蕩24h充分溶解后，按10%體積分數添加新生牛血清，于4℃備用。

1.3.2 對體外培養的腫瘤細胞增殖的影響 選取對數期的 Hela和SGC-7901，經0.25%胰酶消化后，按1×104個·mL－1的密度接種于96孔板，每孔200μL。設不同濃度水凝膠實驗組、細胞對照組及空白對照組，每組5個復孔。37℃、5%CO2常規培養24h，待細胞貼壁完全后，棄去原培養基，實驗組分別添加不同濃度的水凝膠溶液，細胞對照組添加等量的培養基。所用培養基為含10%新生牛血清的RPMI1640培養基。

上述各組細胞分別培養2、4及6d，于倒置顯微鏡下觀察細胞形態。MTT法測其在492nm處吸光度。按下列公式計算相對增殖率（RGR）。

其中：Ao，Al，A2分別為空白組，實驗組及對照組的吸光值。

1.3.3 體內抑瘤實驗 實驗動物飼養一周以適應環境。取腹腔接種7d，生長良好的S180荷瘤小鼠，頸椎脫臼處死。無菌條件下抽取腹水，離心，棄上清，用生理鹽水調細胞濃度為2×107個·mL－1，接種于正常小鼠左前肢腋窩皮下，每只0.2mL。造模24h后隨機分為高劑量水凝膠組、低劑量水凝膠組和模型組，每組10只。采用腹腔注射方式給藥，其中實驗組注射劑量分別為25和12.5mL·kg－1，模型組每只注射生理鹽水0.5mL，隔天一次，共14d。實驗動物于末次給藥后24h，采血后處死。給藥前后的體重變化用于評價水凝膠對機體的毒副作用。剖離瘤塊，稱取瘤重，計算抑瘤率。分離胸腺、脾臟，并稱重，分別計算胸腺指數和脾臟指數。血液于室溫存放4h后以3 000r·min－1離心15 min提取血清。按照Elisa試劑盒說明書測血清中TNF-α、IL-2及IFN－γ含量。計算公式如下：

1.4 統計學分析

實驗數據以應用SPSS13.0軟件進行統計學分析，組間比較采用單因素方差分析（one way ANOVA）。

2 結果

2.1 水凝膠對Hela及SGC-7901體外增殖的影響

水凝膠對體外培養的Hela細胞和SGC-7901細胞生長增殖的影響見圖1和2。圖1（1）顯示了實驗組和對照組Hela細胞生長的狀態，圖1（2）顯示了實驗組和對照組SGC-7901細胞生長的狀態，可見對照組細胞排列整齊，狀態良好；各實驗組均有部分細胞呈現不同程度的變圓現象，并伴有細胞碎片出現，該現象隨水凝膠作用時間的延長趨于明顯，并且低濃度范圍實驗組的細胞密度明顯低于對照組。

圖2顯示了在不同濃度水凝膠作用下的細胞相對增殖率。2d時，與細胞對照組相比，水凝膠濃度為0.001、0.002 5及0.005g·mL－1的3個實驗組的2種細胞生長均呈現顯著性或極顯著性差異（P＜0.05或P＜0.01）。3個組對 Hela細胞的相對增殖率分別為80.40%、88.94%和90.10%，對 SGC-7901 的相對 增殖率分別為86.52%、92.83%和89.17%；4d時，水凝膠濃度為0.001和0.01g·mL－1的實驗組的Hela細胞生長呈現顯著性差異，相對增殖率分別為87.65%和91.84%。6d時，水凝膠濃度為0.001和0.0025g·mL－1的2個實驗組的Hela細胞生長呈現極顯著性差異，相對增殖率分別為83.81%和86.13%。水凝膠濃度為0.025、0.05、0.1、0.25g·mL－1的4個實驗組在3個時間點對兩種細胞生長的影響作用不明顯。實驗結果顯示了水凝膠對體外培養的Hela細胞和SGC-7901細胞的生長具有顯著抑制作用，且在低濃度時效果較好。

圖1 不同水凝膠濃度6d時對Hela細胞及SGC-7901細胞形態的影響Fig.1 Effects of CH on the morphology of Hela and SGC-7901treated for 6d

圖2 水凝膠對Hela細胞及SGC-7901細胞體外增殖的影響Fig.2 Effects of CH on the proliferation of Hela and SGC-7901in vitro

2.2 水凝膠對荷瘤小鼠腫瘤組織生長的影響

給藥14d，S180荷瘤小鼠實驗組飲食正常，狀態良好。體重變化方面，低劑量組小鼠體重高于模型組，高劑量組小鼠體重略低于模型組，但均沒有顯著性差異，顯示了水凝膠的毒副作用不明顯（見表1）。腫瘤體積方面，實驗組腫瘤體積明顯小于模型組，如圖3所示。與模型組比較，實驗組瘤重減小，其中低劑量水凝膠組的瘤重與模型組瘤重相比呈現顯著性差異（P＜0.05），顯示了低劑量組水凝膠對腫瘤組織生長的抑制作用。

表1 水凝膠對實體瘤S180小鼠腫瘤生長的影響Table 1 Effect of CH on the growth of solid S180tumor in mice（n＝10，m±SD）

圖3 水凝膠對小鼠S180腫瘤形態的影響Fig.3 Effect of CH on the morphology of solid S180tumor

2.3 水凝膠對荷瘤小鼠免疫系統的影響

水凝膠對荷瘤小鼠免疫系統的影響結果見表2和圖4。由表2可見，水凝膠可提高荷瘤小鼠的胸腺指數和脾臟指數，其中低劑量水凝膠組的胸腺指數較模型組，呈現顯著性差異（P＜0.05）。圖4顯示了低劑量水凝膠組和高劑量水凝膠組可顯著增加TNF－α、IL-2及IFN-γ三種細胞因子的表達水平，與對照組相比，兩實驗組的 TNF－α、IL-2水平呈現顯著性差異（P＜0.05），IFN-γ水平呈現極顯著性差異（P＜0.01），顯示了水凝膠具有提升免疫力，增強免疫系統的防御功能。

表2 水凝膠對荷瘤小鼠胸腺指數和脾指數的影響Table 2 Effects of CH on thymus index and spleen index in tumor-bearing mice（n＝10，M±SD）

圖4 水凝膠對荷瘤小鼠血清中TNF－α、IL-2及IFN－γ水平的影響Fig.4 Effects of CH on the of serum levels of TNF-α，IL-2and IFN-γin tumor-bearing mice

3 討論

本研究探討了水凝膠對腫瘤在體內外生長的影響。體外細胞增殖實驗表明，低濃度水凝膠一方面能在一定程度上抑制腫瘤細胞生長，破壞腫瘤細胞正常形態；另一方面不產生細胞毒性，具有良好的安全性。其體外抑瘤效果在2d時最為明顯，隨后逐漸減弱，6d時略有增強。同時實驗組可觀察到微小膠體顆粒存在，說明水凝膠溶液內有少許重新成膠現象，其作用緩慢可能與成膠后的緩釋有關。

體內抑瘤實驗效果明顯，水凝膠能更好地發揮抗腫瘤活性，優于體外效果。在體內實驗中，水凝膠不僅能抑制實體瘤的生長，還可以提高免疫器官指數、激活免疫細胞，誘導 TNF－α、IL-2、IFN-γ與抗腫瘤相關的細胞因子分泌，增強機體的免疫能力，進而抵御腫瘤細胞的侵襲。無論體內還是體外實驗，殼聚糖基水凝膠在低濃度或低劑量時，均產生較好的抑瘤作用，并未出現量效關系，相關實驗也未得出統一意見［8］，有關機理尚需進一步研究。

殼聚糖不僅可以用作抗腫瘤藥物的載體，如納米微球［9］、凝膠緩釋體系等［10］；大量研究表明，其本身也具有一定的抗腫瘤活性。文鏡等的研究表明低聚殼聚糖能夠抑制體外培養的腫瘤細胞的DNA合成，發揮抗腫瘤作用［11］。Harish等通過實驗發現水溶性低分子量殼聚糖能夠誘導小鼠艾氏腹水瘤（EAT）細胞凋亡、抑制腫瘤介導的血管生成［12］。Maeda等發現相對分子質量為21和46kD的殼聚糖可抑制S180生長，增強腸上皮和脾的自然殺傷（NK）細胞的活性，且此作用較分子量高的殼聚糖好，并推測出低分子量殼聚糖可能是通過提高腸內免疫功能來發揮抗腫瘤作用［13］。C.Qin等通過酶解得到不同分子量殼聚糖，研究它們對腹水移植S180的小鼠的腫瘤生長影響，結果顯示高分子量殼聚糖的抗腫瘤效果要優于低分子量殼聚糖［14］。王芳宇等通過實驗證明，水溶性殼聚糖能顯著促進荷瘤小鼠 NO、TNF、IFN-γ的生成，提高 NK 細胞活性［15］。另有多項研究發現，殼聚糖及其衍生物的氨基具有明顯的免疫特性，它們并不直接殺死腫瘤細胞，而是通過對機體的免疫調節方式間接達到抑制腫瘤生長的目的［8］。目前，大多抗腫瘤藥物仍存在耐藥問題和易引發不良反應等缺點，而且價格也較昂貴。本研究發現，以天然產物制成的殼聚糖基水凝膠能夠表現出良好的抗腫瘤活性和生物安全性，作為抗腫瘤醫用材料應用于體內具有可行性，為腫瘤治療提供新的手段。

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