差示分光光度法測定獨一味膠囊中總黃酮含量

郭愛玲，張淑蓉，劉曉芳，李 虹，焦建華，裴曉麗

（山西中醫學院，山西太原 030024）

獨一味 Lamiophlomis rotata（Benth.）Kudo 為唇形科獨一味屬僅有的一種植物，是藏、蒙、納西等少數民族常用草藥［1］。以獨一味開發出的國家新藥獨一味膠囊，收載于《中國藥典》2010年版一部，具有活血止痛、化瘀止血的功效。臨床上用于多種外科手術后的刀口疼痛、出血，外傷骨折，筋骨扭傷，風濕痹痛以及崩漏、痛經、牙齦腫痛、出血等病癥的治療［2］。總黃酮是獨一味膠囊的主要有效成分之一，具有多方面生理活性，常作為藥效學和質量控制指標。本文采用差示分光光度法測定該制劑中的總黃酮，操作簡便、結果準確、重現性好，不需分離即可直接用于測定，減少了干擾組分對測定的影響，可為獨一味膠囊的質量控制提供參考。

1 儀器與試藥

UV-1600紫外分光光度計（北京瑞利公司）。蘆丁對照品（中國藥品生物制品鑒定所，批號：100080-200707，含量測定用）；獨一味膠囊（甘肅獨一味生物制藥股份有限公司，批號：0709032004，0902024323，0910032327）；氯化鋁、亞硝酸鈉、二氯氧鋯、乙醇、氫氧化鈉、硝酸鋁、甲醇均為分析純。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液的制備

精密稱取19.56mg蘆丁對照品加入25mL 60%乙醇中，水浴加熱溶解，冷卻，在100mL容量瓶中用60%乙醇定容，搖勻，得0.1956mg/mL對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

在50mL錐形瓶中，精密稱定研細的獨一味膠囊內容物0.6g，加60%乙醇20mL，超聲提取30min，連續提取3次，合并提取物，在100mL容量瓶中用60%乙醇定容，靜置過夜，測定時精密量取上清液。

2.3 測定波長的選擇

精密量取0.8mL對照品溶液2份，分別置于10mL容量瓶中，其中1份加5mL氫氧化鈉試液，再加水到刻度，作為堿性空白；另1份加0.2mL 5%NaNO3溶液，混勻，放置 6min，加 0.5mL 2.5%AlCl3溶液，搖勻，放置6min，加5mL氫氧化鈉試液，再加水到刻度，搖勻，放置40min。在波長400nm～700nm范圍內掃描測定，觀察到517nm處差示吸光度值最大。另取0.2mL供試品溶液2份，根據以上方法，觀察供試樣品絡合前后差示吸收光譜的變化，發現供試品溶液與對照品絡合前后的差示吸收光譜基本一致，在517nm處有較大的差示吸光度值，因此將517nm作為測定波長。

2.4 標準曲線的制備

在10mL容量瓶中，分別移取0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL、3.0mL、3.5mL 對照品溶液各2份，其中1份加5mL氫氧化鈉試液，并用水定容作為參比液；另1份依次加0.2mL 5%NaNO3溶液，混勻，放置 6min，加 0.5mL 2.5%AlCl3溶液，混勻，放置6min，加5mL氫氧化鈉試液，用水定容，搖勻，放置40min。分別于517nm處測定不同濃度溶液絡合前后吸光度的差值△A。以△A與對照品溶液的濃度C作回歸分析，可得回歸方程：△A=9.6375C+0.0017，r=0.9997。說明蘆丁在9.78μg/mL～68.46μg/mL濃度范圍內具有良好的線性關系。

2.5 穩定性實驗

加入絡合劑后的供試品溶液在室溫下放置不同時間，于517nm測定絡合前后吸光度的差值，結果顯示，40min內絡合反應達到平衡，在1h內顯色比較穩定。

2.6 精密度實驗

精密移取2份1.0mL供試品溶液，按2.4項方法連續測定吸光度值6次，測得RSD為0.07%，說明該方法精密度良好。

2.7 重復性試驗

對同一批樣品制備6份供試品溶液，分別精密移取1.0mL供試樣品溶液，按2.4項方法操作測定，計算總黃酮含量，RSD為2.7%，說明該方法重復性較好。

2.8 加樣回收率試驗

在10mL容量瓶中，精密移取已知含量的供試樣品溶液若干份，分別加入適量的蘆丁對照品溶液，按2.4項方法測定，計算回收率，平均回收率是100.31%，RSD 為 2.13%（n=6），結果見表 1。

2.9 樣品含量測定

分別精密移取1.0mL不同批號的樣品溶液各2份，按2.4項方法操作，在517nm處測定各樣品溶液的差示吸光度值△A，各樣品溶液平行測定3次，取平均值，代入標準曲線方程，計算各樣品中總黃酮的含量，結果見表2。

表1 加樣回收率試驗 （n=6）

表2 不同批號的樣品總黃酮含量 （n=3）

3 討 論

3.1 提取方法和溶媒的選擇

本實驗選擇比較了5種不同溶劑即甲醇、50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇超聲提取30min和水浴提取30min的提取效率，結果表明超聲提取率高于水浴提取率，乙醇提取率高于甲醇提取率，50%～60%乙醇提取效果較好，但50%乙醇提取液不容易澄清。因此，確定以60%乙醇進行超聲提取，既保證測定溶液的澄清，又符合含量測定的需要。

3.2 顯色劑的選擇

參照文獻［3-5］和《中國藥典》（2010版一部），對 2%ZrOCl2·8H2O 溶液、2.5%AlCl3溶液和 5%NaNO2-2.5%AlCl3-NaOH試液混合體系3種顯色劑分別進行了探討。結果表明5%NaNO3-2.5%AlCl3-NaOH試液顯色體系準確度和靈敏度最高。故本實驗采用此顯色劑。另外對5%NaNO3溶液、2.5%AlCl3溶液和NaOH試液的加入量進行了考察，結果表明，以加入5%NaNO3溶液0.2mL、2.5%AlCl3溶液0.5mL和NaOH試液5mL為最佳試劑加入量。

通過獨一味膠囊中總黃酮超聲提取及含量測定方法的加樣回收率、重現性、穩定性等實驗，表明該方法簡單、可靠，可用于獨一味膠囊中總黃酮的含量測定，并為其生產質量控制方法提供一定的參考意義。

［1］吳征鎰.西藏植物志（第四卷）［M］.北京：科學出版社，1985：158.

［2］中華人民共和國藥典委員會.中華人民共和國藥典［M］.北京：中國醫藥科技出版社，2010：939-940.

［3］彭燕，王本富，苗愛東，等.差示分光光度法測定白花蛇舌草注射液中總黃酮的含量［J］.華西藥學雜志，2008，23（1）：109-110.

［4］薛淑萍，張立偉.大孔吸附樹脂提取、分離桑葉總黃酮的條件優化［J］.山西中醫學院學報，2006，7（1）：51-52.

［5］龔燕波，方崇波.差示分光光度法測定復方刺梨合劑中總黃酮的含量［J］.海峽藥學，2008，20（11）：46-48.