不同心功能糖尿病心肌病大鼠瞬時外向鉀電流的變化及意義

劉星，張良勝，楊錦龍，陳俞瑾，諸波，査克嵐，楊悠，范忠才

（1瀘州醫學院附屬醫院，四川 瀘州 646000;2永城市人民醫院）

糖尿病心肌病（DCM）是糖尿病常見的心血管并發癥，其發病率高，常伴發多種心律失常，是導致患者心力衰竭和死亡的主要原因［1，2］。心律失常的發生除與基礎疾病造成的心臟結構改變（即結構重構）外，還和電流通道改變（即電重構）有密切關系。就單個心肌細胞而言，瞬時外向鉀電流（Ito）是參與細胞1期復極及平臺期形成的主要離子流，對動作電位不應期的形成及維持其穩定性起著重要作用。當Ito發生改變時，必將導致心肌細胞動作電位變化，從而可能引起心律失常。2012年12月～2013年11月，本研究通過比較不同心功能DCM大鼠心肌細胞Ito的變化，進而探討在不同病理狀態下其離子通道變化情況以及心律失常可能的發生機制。

1 材料與方法

1.1 材料 動物:清潔級SD成年大鼠30只，均為雄性，體質量180～220 g，購于第三軍醫大學醫學實驗動物中心。主要試劑:復合麻醉劑、膠原酶Ⅱ、乙二醇雙四乙酸、羥乙基哌嗪乙磺酸、鏈脲佐菌素（STZ），均為Sigma公司產品。主要儀器:動物呼吸機（江西特力呼吸機設備公司），GE Vivid7.0心臟超聲心動儀（美國GE），膜片鉗放大器（CEZ-2300，Nihon konden，Japan），A/D轉換器（Digidata 1322A，Axon Instruments，USA），三維操縱器（WN 203，Narishige，Japan），電極經橫式拉制機（P-97 sutter，USA），Langendorff灌流裝置（ML176，Austrilia）等。

1.2 動物分組及DCM、DCM心衰模型的建立 30只大鼠隨機分成3組:對照組（n=10）、DCM組（n=10）、DCM心衰組（n=10）。對照組始終以普通飼料喂養，DCM組及DCM心衰組均以高脂飲食喂養。DCM組:10只SD大鼠，喂養至第6周以1%STZ 30 mg/kg腹腔注射，對照組以同體積檸檬酸緩沖液一次性腹腔注射。72 h后尾靜脈取血測血糖，空腹血糖≥11.1 mmol/L判斷為2型糖尿病造模成功。造模成功后繼續高脂高糖飼料喂養6周。DCM心衰組:10只SD大鼠按照上述方法制作成DCM大鼠，于注射STZ后第3周進行左冠狀動脈結扎術:用復合麻醉劑進行腹腔注射麻醉，氣管插管，設定呼吸機參數（呼吸頻率90次/min，呼吸比1∶1，潮氣量10～12 mL）。胸骨左側3～4肋間開胸，暴露心臟，在左心耳和肺動脈圓錐之間用5-0絲線結扎左冠狀動脈前降支，觀察左室前壁心肌顏色變蒼白，搏動減弱時關閉胸腔。大鼠自主呼吸恢復后拔除氣管插管。術后傷口定期換藥，繼續高脂高糖飼料喂養至術后第3周。同時選擇對照組大鼠進行假手術，實驗步驟與前相同但不結扎左冠狀動脈。

1.3 心功能的測定 DCM組和DCM心衰組分別于結扎術后第3周，采用GE Vivid7.0心臟超聲心動儀12S探頭，經大鼠胸骨左心長軸乳頭肌切面分別測量:左室舒張末內徑（LVEDD）、左室收縮末內徑（LVESD），每次測量3個心動周期后取平均值。并根據Teichholtz矯正公式計算出左室射血分數（LVEF）、左室內徑縮短率（LVFS）。

1.4 病理學變化的觀察 隨機抽取對照組、DCM組及DCM心衰組各3只大鼠左心室進行連續切片，然后HE染色、顯微鏡下觀察并拍照記錄病理變化。

1.5 心肌細胞的分離 將無鈣臺液、KB液和酶液分別用95%O2和5%CO2飽和30 min，打開與Langendorff相連的恒溫浴槽。用去離子水沖洗Langendorff系統10 min。將3%戊巴比妥鈉0.2 mL/100 g、肝素4 U/g注入SD大鼠腹腔。麻醉成功后，剪開大鼠胸腔，迅速取出心臟后置于4℃無鈣臺液中，經主動脈逆行插管，固定于Langendorff灌流裝置上。先用無鈣臺液沖凈殘存在冠狀動脈和心室中的血液，換成消化酶液，以8 mL/min持續灌流6～7 min，然后每隔1 min剪取一小塊左心室組織，共10次，依次裝于盛有KB液的10個小瓶中。將取下的心肌組織塊剪碎，用吸管輕輕吹打，再用200目篩網過濾，得到細胞混懸液，置于氧飽和的KB液保存，室溫下1 h后置于4℃冰箱中備用。

1.6 Ito電流密度的測定 取急性酶分離的大鼠心肌細胞，采用全細胞膜片鉗記錄模式記錄電流。選擇細胞膜光滑完整、橫紋清楚、無收縮的細胞，制作形成細胞貼附式膜片，在此基礎上，向微電極內給予較強的負壓形成全細胞記錄構型。最后施以Ito刺激方案，保持電位于-80 mV下，以10 mV為階躍，自-50 mV去極化至+70 mV，鉗制時間為300 ms引導出Ito刺激波形。使用膜片鉗放大器記錄電流信號，經 A/D轉換器處理后，用 Clampex（version 10.1）軟件系統采集后儲存于計算機中。采樣頻率為10 kHz，采樣方式為Clampex下的Episodic stimulation［3］。電流密度 = 電流強度（I）/膜電容（c）。

1.7 統計學方法 采用 SPSS17.0統計軟件。結果以±s表示，3組比較采用單因素方差分析、組間比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組心功能指標比較 見表1。

2.2 各組心肌病理切片觀察結果 對照組心肌纖維排列整齊，可見橫紋，胞質豐富，細胞間隙正常。DCM組及DCM心衰組心肌細胞排列紊亂、扭曲、部分斷裂，纖維化明顯，符合DCM心肌病理變化，其中尤以DCM心衰組大鼠表現顯著。

表1 各組 LVEDD、LVESD、LVEF、LVFS 比較（±s）

表1 各組 LVEDD、LVESD、LVEF、LVFS 比較（±s）

注:與對照組比較，﹟ P ＜0.05;與 DCM組比較，▲P ＜0.05。

組別 n LVEDD（mm） LVESD（mm） LVEF（%） LVFS（%）對照組 10 5.72±0.45 4.07±0.35 61.62 ±4.34 32.12±3.82 DCM 組 10 5.76±0.48 4.09±0.47 61.37 ±5.85 31.85±4.13 DCM 心衰組 10 7.82±0.46﹟▲ 6.74±0.52﹟▲ 44.86±4.25﹟▲ 19.29±3.98﹟▲F 67.86 114.99 38.88 33.93 P 0.00 0.00 0.00 0.00

2.3 各組左心室心肌細胞Ito變化 施以Ito電流刺激方案后，引導出各實驗組Ito電流圖（圖1）。各組Ito的電流密度比較見表2。各組I-V曲線見圖2。3組的I-V曲線均呈線性依賴性，為內向整流特性，從指令電壓-50 mV至-20 mV，電流幅度增加不明顯，3組曲線走向均平緩。從指令電壓-20 mV至+70 mV，對照組電流增幅較大，而 DCM組及DCM心衰組增幅較小，兩者均較對照組明顯下移，尤其是在指令電壓+10 mV以后更為明顯，且以DCM心衰組下移顯著。見圖2。

圖1 各組Ito電流圖及Ito刺激方案

圖2 各組I-V曲線圖

3 討論

DCM是以心肌代謝紊亂為特征的特異性心肌疾病，其發病率高，是糖尿病的主要心血管并發癥［1，2］。DCM 早期主要表現為舒張功能降低，晚期以收縮功能障礙為主，而隨著心功能的變化其心律失常概率也明顯增加，是導致患者死亡的主要原因［4，5］。一方面，心功能下降使心臟極易發生各種心律失常［6］。另一方面，糖尿病本身是多種心律失常的致病因子或高危因素，如房顫、室性心律失常等［7，8］。但DCM發病的具體機制目前并不完全清楚。心律失常的發生與心臟的結構重構和電重構有密切關系。因此，推測DCM心律失常的發生除與其代謝紊亂造成的心肌結構變化外，可能還與離子流及其通道的改變有關。單個心肌細胞存在多種離子通道，其正常分布和離子流規則活動是維持心肌細胞正常電活動的基礎。其中，K+直接參與心肌電興奮的恢復過程，對心肌動作電位時程（APD）的長短具有決定性作用，故K+濃度及K+通道的變化是導致嚴重心律失常的重要因素。Ito是主要的外向性K+流，在心肌動作電位0相時被激活，參與了動作電位1相復極過程，并對動作電位2相的起始水平起決定性作用;調節L-Ca2+通道及Na+-Ca2+交換的活性，從而對APD有明顯影響［9］。有研究認為，單純Ito減小使動作電位平臺起點較高（位于正電壓水平），導致Ca2+內流電-化學驅動力下降，Ca2+內流減小、復極加快進而使APD縮短，可引發各種心律失常［10］。因此，研究Ito在電重構中的作用有重要意義。

表2 各組Ito的電流密度比較（n=10，pA/pF，±s）

表2 各組Ito的電流密度比較（n=10，pA/pF，±s）

注:與對照組比較，*P ＜0.05。

測試電壓（mV） 對照組 DCM組 DCM心衰組-50 0.05 ±0.02 0.13 ±0.01 0.14 ±0.12-40 0.06 ±0.04 0.17 ±0.31 0.20 ±0.03-30 0.49 ±0.40 0.86 ±0.82 1.02 ±1.02-20 1.91 ±0.83 1.98 ±0.14 2.07 ±2.33-10 4.35 ±2.01 3.61 ±2.45 3.39 ±3.35 0 6.92 ±2.80 4.62 ±4.05 4.09 ±4.05+10 8.90 ±3.20 6.10 ±5.31 5.28 ±5.06+20 12.50 ±4.00 7.21 ±5.30 6.49 ±6.02+30 17.07 ±4.52 10.12 ±6.30 7.92 ±7.03+40 24.15 ±4.72 11.40 ±6.85 9.05 ±7.35+50 27.90 ±5.02 13.74 ±7.12 10.83 ±8.01+60 32.11 ±4.52 15.31 ±8.71 12.05 ±9.02*+70 38.65 ±5.05 17.70 ±9.21* 15.22 ±9.13*

本研究主要證實了DCM大鼠心室肌細胞存在Ito電流密度的變化，并且隨著心功能的下降其變化更加明顯。首先，對比DCM組和對照組:當電壓為+70 mV時，DCM組的Ito電流密度較對照組明顯降低，I-V曲線也較對照組下移明顯。結合分析大鼠周齡及心臟功能變化，說明在出現收縮功能障礙前即DCM大鼠僅有舒張功能下降時就出現了Ito的減弱，這可能是DCM發生心律失常的早期離子基礎。其次，對比DCM心衰組和對照組:當電壓為+60 mV時，DCM心衰組的電流密度就比對照組明顯降低，這比DCM組出現要早，從I-V曲線看，DCM心衰組較對照組下移更加明顯。結合心功能變化，說明當DCM大鼠出現收縮功能障礙時，Ito的變化更加顯著，這可能是DCM晚期極易發生心律失常的原因之一。雖然DCM組和DCM心衰組在Ito電流密度的變化上沒有統計學意義，但通過分析I-V曲線變化的趨勢以及與對照組對比其變化的時間早晚，我們認為DCM心衰組有變化更為顯著的趨勢，這說明隨著DCM心功能的改變其Ito亦隨之變化，推測改善心功能可有助于穩定其Ito。

總之，DCM除因代謝紊亂造成的心肌結構的改變，其還存在電活動的改變，尤其當心功能下降時這種改變更加顯著，這些變化共同組成了DCM心律失常的基礎，其中Ito扮演著重要角色。對DCM電重構的深入研究將有助于闡明其心律失常的機制，并有助于尋找特異性的治療方案。

［1］Boudina S，Abel ED.Diabetic cardiomyopathy revisited［J］.Circulation，2007，115（25）:3213-3223.

［2］Cai L，Kang YJ.Oxidative stress and diabetic cardiomyopathy:a brief review［J］.Cardiovasc Toxicol，2001，1（3）:181-193.

［3］劉振偉.實用膜片鉗技術［M］.北京:軍事科技出版社，2006:90-103.

［4］van Melle JP，Bot M，de Jonge P，et al.Diabetes，glycemic control，and new-onset heart failure in patients with stable coronary artery disease:data from the heart and soul study［J］.Diabetes Care，2010，33（9）:2084-2089.

［5］Fagher K，L?ndahl M.The impact of metabolic control and QTc prolongation on all-cause mortality in patients with type 2 diabetes and foot ulcers［J］.Diabetologia，2013，56（5）:1140-1147.

［6］Cai C，Hua W，Ding LG，et al.High sensitivity C-reactive protein and cardfiac resynchronization therapy in patients with advanced heart failure［J］.J Geriatr Cardiol，2014，11（4）:296-302.

［7］Nichols GA，Reinier K，Chugh SS.Idependent contribution of diabetes to increased prevalence and incidence of atrial fibrillation［J］.Diabetes Care，2009，32（10）:1851-1856.

［8］Huxley RR，Alonso A，Lopez FL，et al.Type 2 diabetes，glucose homeostasis and incident atrial fibrillation:the Atherosclerosis Risk in Communities Study［J］.Heart，2012，98（2）:133-138.

［9］Grant AO.Cardiac ion channels［J］.Circ Arrhythm Electrophysiol，2009，2（2）:185-194.

［10］Tomita F，Bassett AL，Myerburg RJ，et al.Diminished transient outward currents in rat hypertrophied ventricular myocytes［J］.Circ Res，1994，75（2）:296-303.