胃癌組織VIP與癌組織炎性細胞內NKG2D、PI3K p85α、NF-κB p65 表達的關系

萬娟，孫姚，王翀，李媛媛，李國華

(1海洋石油總醫院，天津300452;2新余市人民醫院;3南昌大學第一附屬醫院)

近年多項研究表明，血管活性腸肽(VIP)在腫瘤免疫逃逸方面發揮一定作用［1～7］，但其作用機制研究尚少。NKG2D是NK基因復合體中的klrkl編碼的Ⅱ型膜蛋白［8］，在 NK、γδ+T 細胞和 CD+8T 細胞介導的對腫瘤的免疫清除中起重要作用。結合NKG2D與VIP分別在胃癌免疫監視與逃逸中的作用，同時二者某些信號通路相同，但方式相反(興奮或抑制)。因此，推測VIP對NKG2D信號通路有抑制作用，并可能在胃癌的免疫逃逸中起重要作用。本研究分析了胃癌組織中VIP與癌組織炎性細胞內NKG2D、磷酸肌醇3激酶(PI3K)p85α、核轉錄因子κB(NF-κB)p65的關系。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2008年9月～2009年6月在南昌大學第一附屬醫院行胃癌手術者72例，術前均未接受手術或放化療治療，術中收集胃癌及癌旁正常胃黏膜組織。患者中，男52例，女20例;年齡40～60歲34例，≥60歲38例;病灶位于胃竇44例，胃體28例;有淋巴結轉移44例，無淋巴結轉移28例;癌組織高、中分化24例，低分化48例;TNM分期Ⅰ～Ⅱ期30例，Ⅲ～Ⅵ期42例。

1.2 方法

1.2.1 胃癌及癌旁正常胃黏膜組織中 VIP、NKG2D、PI3K p85α、NF-κB p65 檢測方法 所有標本固定后組織切片，采用免疫組化法(PV-9000及PV-6003二步法)進行染色。兔抗人VIP蛋白多克隆抗體工作濃度為1∶1 000，羊抗人NKG2D蛋白單克隆抗體工作濃度為1∶100，鼠抗人PI3K p85α蛋白單克隆抗體工作濃度為1∶200，鼠抗人 NF-κB p65蛋白多克隆抗體工作濃度為1∶50。所有步驟按產品說明進行，以PBS替代一抗作為陰性對照，用相應已知陽性切片作為陽性對照。免疫組織化學染色顯示VIP主要位于癌細胞質內，NKG2D主要位于炎性細胞膜內，PI3K p85α主要位于炎性細胞質內，NF-κB p65主要位于炎性細胞核內。結果判斷標準:①染色強度評分:棕褐色3分，棕黃色2分，淺黃色1分，著色很弱或未著色0分。②陽性細胞百分率計分:光鏡下隨機觀察5個高倍視野(×400)，陽性細胞百分率0～5%為0分，5%～50%為1分，50%～75%為2分，＞75%為3分。二者相乘0分為陰性(-)，1～3分為弱陽性(+)，4～6分為中等強度陽性(++)，9分為強陽性(+++);+～+++均判為陽性。

1.2.2 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件。陽性表達率比較采用χ2檢驗，等級資料比較用χ2或秩轉換的非參數檢驗(Kruskal-Walls H檢驗)，相關關系采用Spearman等級相關分析法。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 VIP、NKG2D、PI3K p85α、NF-κB p65 在胃癌及癌旁正常組織中的表達情況 見表1、2。

表1 胃癌及癌旁正常組織中VIP、NKG2D、PI3K p85α、NF-κB p65 陽性表達率比較(n=72，%)

表2 胃癌及癌旁正常組織中VIP、NKG2D、PI3K p85α、NF-κB p65陽性表達強度比較(n=72，例)

2.2 VIP、NKG2D、PI3K p85α、NF-κB p65 表達強度與胃癌臨床病理參數的關系 見表3。

2.3 胃癌組織VIP與癌組織炎性細胞內NKG2D、PI3K、NF-κB表達的關系 胃癌組織VIP表達與癌組織炎性細胞內 NKG2D、PI3K p85α、NF-κB p65 表達均呈負相關 (r分別為 -0.341、-0.245、-0.249，P 均 ＜0.05)。

3 討論

VIP屬于胰泌素—胰高血糖素家族，是中樞和外周神經系統的重要遞質;VIP受體廣泛存在于不同動物種群的多種組織中，屬于G蛋白偶聯家族Ⅱ型受體;VIP與VPAC受體結合后，主要通過上調cAMP、腺苷酸環化酶和磷脂酶C，在多種固有免疫細胞中發揮作用［9～11］。

我們前期相關研究表明，胃癌中VIP mRNA表達增高，40%的胃癌組織含VIP陽性腫瘤細胞;VIP在體外對胃癌SGC7901細胞的生長有潛在的抑制作用，但這種抑制作用可以逐漸去敏感。本研究顯示，胃癌較癌旁正常組織中VIP的表達強度明顯增強，且與胃癌的組織分化程度、淋巴結轉移、TNM分期有關(P均 ＜0.05)。結合 VIP的“神經—內分泌—免疫”調節方式，說明VIP在胃癌的免疫逃逸中可能具有重要的作用［1～6］。

表3 VIP、NKG2D、PI3K p85α、NF-κB p65表達強度與胃癌臨床病理參數的關系

NKG2D表達于多種免疫細胞并調節其功能，如NK細胞、T細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞，參與適應性及固有性免疫應答。NKG2D介導的免疫監視在限制腫瘤的發生、發展中起重要作用［12～14］。本研究顯示，在胃癌組織炎性細胞內NKG2D陽性表達率及表達強度均低于癌旁正常組織，且與胃癌的組織分化程度、淋巴結轉移、TNM分期有關(P均 ＜0.05)。說明胃癌組織中免疫細胞表面NKG2D表達下調，可能使機體免疫監視作用減弱，從而助長了胃癌的發生、發展。那么，NKG2D表達下調的原因何在。本研究顯示，胃癌組織中VIP表達與胃癌組織中炎性細胞內NKG2D表達呈負相關。提示胃癌組織中VIP可能通過抑制癌組織中炎性細胞NKG2D的表達，降低機體或局部的免疫監視作用，促使癌細胞逃避免疫細胞的殺傷，從而參與胃癌的免疫逃逸。

NKG2D活化信號的傳導主要通過接頭蛋白DAP10、DAP12與受體結合。接頭蛋白DAP10含有與CD28胞質段類似的YXXM序列，可與PI3K結合活化下游分子［15］。由于PI3K在炎性細胞中的廣泛作用，PI3K表達下調或活性下降可削弱炎性反應和免疫反應［1］。PI3K及其下游蛋白Akt構成的PI3K/Akt信號傳遞途徑是細胞信號轉導的經典途徑之一，并與多種免疫細胞的增殖、分化、活化、對靶細胞的殺傷及人類腫瘤的發生、發展密切聯系［16～19］。NF-κB是PI3K/Akt信號途徑下游調節細胞凋亡的關鍵因子，廣泛存在于多種細胞中，包括淋巴細胞及非淋巴細胞，在炎癥反應、免疫及細胞增殖、凋亡等多過程的基因調控中發揮著重要作用。其通過對細胞因子及免疫受體等編碼基因的轉錄調控來實現對機體的免疫調控，特別是在創傷、感染及機體免疫功能紊亂的情況下發揮作用。

PI3K/NF-κB及其介導的細胞信號轉導通路在多種細胞功能中發揮著重要作用，使其成為研究熱點［20］，而且主要研究集中在腫瘤細胞中PI3K/NF-κB調控信號的改變，特別是其抗細胞凋亡及對細胞周期的調控作用，與腫瘤的發生、發展關系密切，但PI3K/NF-κB在腫瘤細胞免疫逃逸過程中的作用研究尚少。本研究結果顯示，PI3K p85α、NF-κB p65在胃癌組織炎性細胞內的陽性表達率及表達強度均顯著低于癌旁正常組織，與胃癌的組織分化程度、淋巴結轉移、TNM分期有關(P均＜0.05)，且VIP與PI3K p85α、NF-κB p65表達強度呈負相關。而我們的前期研究提示，癌細胞中 PI3K p85α、NF-κB p65表達明顯上調，在炎性細胞中表達下降的原因何在呢?可能有以下幾點原因:①VIP受體在癌細胞中表達明顯下調，使VIP對PI3K、NF-κB的抑制作用明弱;②胃癌組織內可能存在其他細胞因子和(或)相關因素對VIP的作用產生抵抗;③胃癌患者體內非經典的MHC-Ⅰ類分子(如MHC-E、MHC-G)表達增多和(或)其他細胞因子的作用，抑制了NK等細胞相關活化性信號NKG2D/DAP10/PI3K/NF-κB的作用［21］。④受癌組織中其他癌基因或抑癌基因產物的影響。

綜上所述，胃癌組織中的炎性細胞主要是參與免疫功能的免疫細胞，因此胃癌組織中的VIP可能通過抑制癌組織炎性細胞內NKG2D/PI3K/NF-κB信號轉導通路，進而抑制機體局部免疫細胞的監視作用，達到胃癌免疫逃逸的目的。但是，VIP抑制NKG2D后是抑制其下游分子的作用，還是對通路中其他分子也有直接作用，有待進一步研究。

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