梗阻性無精子癥患者睪丸與附睪精子DNA完整性和頂體完整率、反應率對比分析

何泳志，李大文，成俊萍，萬里凱，肖鑫，龔國通

(1廣西壯族自治區人民醫院，南寧530021;2廣西中醫藥大學)

據WHO統計預測，不孕不育將成為僅次于腫瘤和心腦血管疾病的第三大疾病［1］。在不孕不育原因中，男性因素約占40%。梗阻性無精子癥(OA)是男性不育的常見原因，卵胞質內單精子注射(ICSI)是其常用的治療措施。為獲得更好的精子助孕，我們對比分析了OA患者睪丸與附睪精子DNA完整性、頂體完整率和反應率的差異。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 入選標準:①年齡20～40歲;②精液常規檢查≥3次，離心后確認精子數為0;③性激素檢查促卵泡激素(FSH)基本正常;④睪丸體積＞30 mL或單側體積＞15 mL，睪丸活檢存在精子;⑤排除其他原因導致的不育;⑥需行ICSI助孕者。選擇2012年6月～2014年12月廣西壯族自治區人民醫院收治的符合入選標準的OA患者240例，其中經睪丸取精110例(A組)、附睪取精140例(B組)。A 組年齡(28.56 ±2.18)歲，睪丸體積(29.92±2.09)mL，血清睪酮(519.04 ±92.08)ng/dL、FSH(7.04 ±2.36)IU/L;B 組年齡(28.81 ±2.31)歲，睪丸體積(29.84 ±2.07)mL，血清睪酮(522.33 ±88.03)ng/dL、FSH(7.37 ±2.22)IU/L;兩組臨床資料具有可比性，P均＞0.05。

1.2 方法

1.2.1 取精方法 A組行經皮睪丸精子抽吸術(TESA)。患者取仰臥位，常規消毒、鋪巾。術者左手固定一側睪丸，用1%利多卡因行精索阻滯，在穿刺點亦行局麻。術者右手握帶側孔的12號針經皮穿刺進入睪丸，由助手用60 mL注射器吸取精子洗滌液2 mL，接上針頭后抽吸，直至吸出組織，移入含精子洗滌液的培養皿中。磨碎精曲小管，在倒置顯微鏡下觀察精子。如找不到精子，可改變方向再次穿刺，甚至穿刺另一側睪丸。B組行經皮附睪精子抽吸術(PESA)。術前準備及麻醉同 TESA。用5 mL注射器吸入少量培養液，直視下用4號半針頭經皮穿刺附睪，負壓抽吸至有淡黃渾濁液體抽出。如未見液體被抽出，可改變穿刺方向重復抽吸。將抽吸出的液體注入含精子洗滌液的培養皿，在倒置顯微鏡下尋找活動的成熟精子。若提取液中無精子或無活動精子，則行對側附睪穿刺。若附睪穿刺無精子，考慮行TESA。

1.2.2 精子DNA完整性觀察 采用精子染色質擴散試驗［2］，進行瑞氏—姬姆薩染色。計數400個精子，普通顯微鏡下觀察精子光暈大小。根據光暈與精子頭部橫徑的比例，將精子粗分為大(＞2/3)、中(1/4～2/3)、小(≤1/4)光暈和無光暈4個等級。大光暈、中光暈表示精子DNA完整無碎片，小光暈、無光暈和退化精子表示精子DNA斷裂為碎片。以精子DNA斷裂指數(DFI)表示DNA完整性，DFI越大完整性越差。DFI=(小光暈精子+無光暈精子+退化精子)/精子總數×100%。

1.2.3 精子頂體完整率及反應率測定 以豌豆凝集素進行染色，用異硫氰酸熒光素進行標記，用450～490 nm激發光，于1 000倍油鏡下觀察涂片。精子頂體完整(AI)為精子頭部一半以上熒光染色明亮且均勻;精子發生頂體反應(AR)為精子僅在赤道帶出現熒光帶，或者在頂體區根本沒有熒光染色。每張圖片精子計數200條，用血球分類計數器計數AI和AR的數目，計算2張重復涂片AI和AR所占比率。

1.2.4 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件。計量資料以±s表示，組間比較用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

兩組DFI、精子頂體完整率、反應率比較見表1。

表1 兩組DFI、精子頂體完整率、反應率比較(%， ± s)

表1 兩組DFI、精子頂體完整率、反應率比較(%， ± s)

注:與 B 組比較，*P ＜0.05。

組別 n DFI 精子頂體完整率 精子頂體反應率A 組 110 31.76 ±23.60 48.39 ±22.46*9.72 ±8.88 B組140 31.17 ±23.47 40.10 ±20.77 9.44 ±8.33

3 討論

大量研究表明，精子DNA和染色質的損傷與男性不育和女性自然受孕率低明顯關聯［3，4］。DFI與ICSI助孕時繼續妊娠率呈負相關，且高水平DFI與ICSI植入率明顯相關［5］。但是，精子DNA區域損傷與受精率降低、植入失敗、流產、嬰兒出生缺陷的關系仍存在爭議［6，7］。國外學者研究發現，在體外受精過程中，精子染色質只與胚胎質量有關，與受精率、妊娠率無關［8］。正常情況下，在核中的精子因有特殊結構DNA非常穩定。精子DNA損傷最重要的機制是不正常的染色質包裝、活性氧和凋亡，外界環境因素包括陰囊溫度過高、吸煙、生殖道感染等。本研究發現，兩組DFI并無差異，提示取精部位不影響DNA完整性。其可能與以下原因有關:①精子發生經過在睪丸、附睪內一系列成熟和修飾過程，不同來源的精子在畸形率、DNA和染色體異常、成熟度和印記基因等方面差異較大。②精子在睪丸尚呈精原細胞狀態，仍是未成熟精子，精子活力差甚至是不動精子;附睪中精子由于慢性炎癥介質，梗阻淤積導致氧化應激損傷。因此，OA患者睪丸與附睪精子DNA完整性無顯著差異。

精子頂體是高爾基體衍生而來的帽狀細胞器，覆蓋在精子核的前2/3區。在受精過程中發生頂體反應是一個基本步驟，頂體膜和細胞質膜混合形成的囊泡在細胞外釋放頂體酶，頂體酶上覆在精子頭部，使精子穿透卵母細胞進行受精［9～11］。睪丸精子已初步發育，并具功能活性的頂體蛋白酶，進入附睪后頂體蛋白酶逐漸發育至功能成熟，而曲細精管和附睪管內液體存在抑制酶活性物質［12］。Michailov等［13］研究發現，鋅離子刺激精子獲能和頂體反應是由表皮生長因子受體激活的，細胞外鋅通過MAP1激酶通路調節細胞增殖;在一部分細胞可作為信號分子，通過其受體調節精子多個信號通路，使精子獲能和發生頂體反應。因此，精子頂體反應率、頂體酶活力及精子膜功能完整性是評價精子功能的重要指標，且精子頂體完整率與頂體內酶的含量及活力明顯相關。研究發現，行ICSI時發生頂體反應，精子植入率升高，且可能更有利于胚胎的質量［14］。本研究發現，睪丸與附睪精子行ICSI時頂體反應率無明顯差異，提示取精部位不影響DNA頂體反應。其與以下原因有關:①OA患者無論睪丸或附睪精子，其整體精子功能質量均較差，包括精子活力、精子正常形態、DNA完整性等，導致精子結合卵透明帶后，在卵透明帶上發生頂體反應均受到影響。②睪丸及附睪精子頂體酶由于自身不穩定，發生自發頂體反應，導致兩者所檢測到的頂體反應率無顯著差異。

有文獻報道，精子頂體完整率與正常形態精子百分率、精子活率、精子活力均呈正相關［15］。有研究報道，在輸精管梗阻時，梗阻下段附睪管腔內壓力增高，精子成熟的局部微環境穩態受到破壞;進一步引起附睪蛋白P34h表達和轉錄障礙，導致其合成和分泌受阻，最終影響精子的成熟及功能的獲得［16，17］。OA患者附睪精子中可觀察到大量精子小頭、小頂體、梨形頭、錐形頭以及尾部缺陷精子，精子頭部大量空泡出現可能是精子在梗阻盲端淤積、降解所致。研究發現，OA患者附睪精子頂體PSA染色熒光染色不均勻，且形態學檢測顯示其附睪精子頭部有大量空泡以及顯著的精子形態異常［18］。本研究顯示，睪丸精子頂體完整率高于附睪精子，差異有統計學意義。其可能原因:①OA多為炎性梗阻，常見的慢性附睪炎可導致附睪纖維化、功能喪失，長期梗阻淤積導致氧化應激損傷，有礙于附睪內精子成熟、發育［19］。②附睪內炎性物質、淤血及組織碎片等易導致精子損傷。由于OA患者睪丸精子頂體完整率優于附睪精子，所以行ICSI結局可能會優于附睪精子。

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