腹腔注射血必凈對膿毒癥急性腎損傷大鼠腎功能的影響及機制探討

程星，曹麗萍，喬佑杰，王永明

（1天津醫科大學，天津 300070;2天津市人民醫院;3天津醫院）

膿毒癥是危重病患者常見死亡病因，而急性腎損傷是膿毒癥常見及嚴重的并發癥，膿毒癥合并急性腎損傷時病死率明顯增加［1］。研究［2］表明，膿毒癥并發急性腎損傷的病死率為74.5%，而不伴有急性腎損傷的病死率為45.2%。膿毒癥是嚴重的全身炎癥反應綜合征，是促炎反應與抑炎反應失衡的結果。巨噬細胞移動抑制因子（MIF）是一種重要的炎癥因子，參與膿毒癥多臟器功能不全綜合征（MODS）及急性腎損傷的發病過程。2013年6～12月，我們觀察了血必凈對膿毒癥急性腎損傷大鼠腎功能的影響，并探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 大鼠MIF酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒、TRIzol購自天津灝洋有限公司，實時定量PCR儀購自杭州博日科技有限公司。

1.2 實驗動物及分組 雄性SD大鼠80只，8～10周齡，體質量200～220 g，購自北京大學醫學部實驗動物中心。按照隨機原則分為對照組16只、模型組32只、干預組32只。

1.3 模型制備及血必凈干預 動物購置后適應性飼養1周，實驗前禁食過夜，自由飲水。模型組及干預組依照Chaudrv等報道的方法進行盲腸結扎穿孔術復制膿毒癥動物模型。10%水合氯醛腹腔注射麻醉，麻醉后固定，常規消毒，鋪無菌洞巾，沿腹正中線作1.5 cm切口，找到盲腸，在盲腸根部進行結扎，避免結扎回腸以及盲腸系膜血管，用16號穿刺針貫通穿刺盲腸2次，并留置一條橡皮片貫通盲腸，防止針孔閉合，最后將盲腸還納腹腔，逐層縫合腹壁切口。術畢立即在動物皮下注射生理鹽水5 mL，以補充術中體液丟失并防止休克，術后自由飲水。對照組麻醉固定后，常規消毒，鋪無菌洞巾沿腹部正中線作1.5 cm切口，打開腹腔，找到盲腸，翻動腸管，然后還納腹腔，其他與模型組、干預組操作一致。對照組及模型組于術后開始腹腔注射生理鹽水4 mL/kg，干預組于術后開始腹腔注射血必凈4 mL/kg，均為每12 h給藥1次，直至動物死亡或實驗結束。

1.4 血清肌酐（Cr）、MIF及腎組織MIF mRNA檢測 實驗動物分別在術后2、8、24、48 h處死（對照組每個時點處死4只，模型組及干預組每個時點處死8只），留取心臟血5 mL，靜置20 min，臺式離心機以3 000 r/min離心15 min，收集血清，-80℃冰箱保存，使用Beckman CoulterDxc800型自動生化分析儀測定血清Cr，采用ELISA法測定血清MIF。稱取腎組織100 mg作為組織標本，用磷酸鹽緩沖液進行沖洗，用液氮保存標本，并制備腎組織勻漿，應用實時定量PCR反應檢測腎組織MIF mRNA。引物由上海生物工程有限公司合成。首先進行腎組織總RNA的制備，然后制備cDNA模板，確定目的基因退火溫度，進行實時定量 PCR反應，反應條件:95℃預變性10 min;94℃變性20 s，59℃退火20 s，40個循環;57～96℃繪制熔解曲線。按RTQ-PCR說明書將各個標本的實時定量PCR結果以經β-actin校正后，應用2-ΔΔCt計算后的比率值表示基因表達的相對變化。

1.5 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件。連續型數據服從正態分布者以±s表示，組內不同時間點比較及組間同一時間點比較均采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗，對檢測指標做Pearson直線相關分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠術后不同時點血清Cr、MIF水平及腎組織MIF mRNA表達比較 結果見表1。

表1 各組大鼠術后不同時點血清Cr、MIF水平及腎組織MIF mRNA 表達比較（ ± s）

表1 各組大鼠術后不同時點血清Cr、MIF水平及腎組織MIF mRNA 表達比較（ ± s）

注:與同組術后2 h比較，AP＜0.05;與同組術后8 h比較，BP＜0.05;與同組術后24 h比較，CP ＜0.05;與干預組比較，aP ＜0.05;與對照組比較，bP ＜0.05。

組別 Cr（μmol/L） MIF（μmol/L）MIF mRNA模型組2 h 32.50 ±2.45 12.89 ±1.25 1.55 ±0.54 8 h 34.13 ±2.36 14.94 ±1.87 2.56 ±1.19 24 h 44.50 ±4.90ABab 18.84 ±4.02ABab 3.97 ±1.67Aab 48 h 69.50 ±5.50ABCab21.90 ±2.97ABCab6.08 ±2.17ABCab干預組2 h 30.13 ±5.11 13.19 ±1.89 1.22 ±0.40 8 h 34.25 ±4.59 13.16 ±2.79 2.13 ±0.86A 24 h 39.50 ±5.93Ab 13.92 ±2.72 2.36 ±0.63A 48 h 44.87 ±8.48ABCb14.00 ±2.23 4.70 ±1.12ABC對照組2 h 31.00 ±1.83 12.24 ±0.91 1.08 ±0.04 8 h 29.50 ±1.29 12.15 ±1.71 1.34 ±0.79 24 h 31.75 ±2.22 11.75 ±0.85 1.87 ±0.72 48 h 32.75 ±1.71 12.83 ±1.45 2.98 ±0.78ABC

2.2 大鼠血清MIF、腎組織MIF mRNA與血清Cr水平的關系 血清MIF水平與血清Cr水平呈正相關（r=0.641，P＜0.05），腎組織 MIF mRNA 與血清Cr水平呈正相關（r=0.696，P＜0.05）。

3 討論

膿毒癥是胰腺炎、創傷、燒傷等臨床危重患者的嚴重并發癥之一，也是誘發MODS的重要病因。膿毒癥的發病與感染、炎癥反應、免疫功能紊亂、凝血功能障礙等因素密切相關，其中炎癥反應是最主要環節。機體產生大量炎癥介質，形成炎癥瀑布效應，造成MODS。多種因素可導致急性腎損傷，包括腎血流量的減少、腎臟毒性藥物的使用及近端小管的細胞損傷或細胞凋亡以及腎臟細胞的炎癥反應［3］，其中膿毒癥導致的急性腎損傷約占50%［4］。膿毒癥時，中性粒細胞、單核巨噬細胞、血管內皮細胞發生復雜的免疫應答反應，釋放出大量炎癥介質，從而造成腎臟損害。2005年9月在阿姆斯特丹舉行的急性腎衰竭國際研討會提出了急性腎損傷分期［5］，以血Cr水平為標準，分為3期，即1期為血清Cr升高＞0.3 mg/dL或增加 ＞50%，2期為 Cr升高 ＞200% ～300%，3期為 Cr增加 ＞300% 或 ＞4.0 mg/dL（急性升高 ＞0.5 mg/dL），表明 Cr水平可評價急性腎損傷嚴重程度。本研究顯示，模型組術后24、48 h血清Cr水平高于對照組，提示模型組大鼠已存在急性腎損傷。血必凈具有清除炎癥介質的作用，有研究表明血必凈可通過抑制MIF的合成與釋放，降低MIF水平［6］，有效地防止腎組織炎癥反應的發生、發展，進而減輕急性腎損傷程度［7］。本研究顯示，干預組術后24、48 h Cr水平低于模型組，提示術后經血必凈干預后，膿毒癥急性腎損傷大鼠腎功能得到改善。

多項研究表明，MIF是一種晚期促炎因子，參與膿毒癥MODS的發病過程［8］，且與膿毒癥的嚴重程度及預后有關，并可預測患者死亡及預后［9，10］。敲除了MIF基因的小鼠對炎癥的免疫應答則明顯減弱［11］，使用抗 MIF因子可明顯降低膿毒癥大鼠MODS 的發生率及病死率［12］。張振輝等［13］研究表明，MIF作為晚期炎性介質參與膿毒癥急性腎損傷的發病過程。Payen［5］研究也表明，膿毒癥患者中，MIF水平隨著腎損傷嚴重程度的加重而升高。本研究顯示，模型組術后24、48 h血清MIF水平及腎組織MIF mRNA高于對照組，而干預組術后24、48 h血清MIF水平及腎組織MIF mRNA低于模型組，且血清MIF水平、腎組織MIF mRNA均與血清Cr水平呈正相關，提示急性腎損傷嚴重程度與血清MIF、腎組織MIF mRNA水平有密切關系，血必凈可能是通過降低血清MIF及腎組織MIF mRNA而達到改善膿毒癥急性腎損傷大鼠腎功能的作用。

［1］Kim WY，Huh JW，Lim CM，et al.A comparison of acute kidney injury classications in patients with severe sepsis and septic shock［J］.Am J Med Sci，2012，344（5）:350-356.

［2］Van Biesen W，Van Massenhove J，Lameire N，et al.Does urinary neutrophil gelatinase-associated lipocalin really solve the issue of discriminating prerenal from intrinsic acute kidney injury［J］.Kidney Int，2012，81（3）:321-322.

［3］Dennen P，Douglas IS，Anderson R.Acute kidney injury in the intensive care unit:an update and primer for the intensivist［J］.Crit Care Med，2010，38（1）:261-275.

［4］Chvojka J.New developments in septic acute kidney injury［J］.Physiol Res，2010，59（6）:859-869.

［5］Payen D.Lukaszewicz AC，Leqrand M，et al.A multicentre study of acute kidney injury in severe sepsis and septic shock:association with inflammatory phenotype and HLA genotype［J］.PLoS One，2012，7（6）:e35838.

［6］急性腎損傷專家共識小組.急性腎損傷診斷與分類專家共識［J］.中華腎臟病雜志，2006，22（11）:661-663.

［7］王文欣，李志軍.血必凈對膿毒癥SD大鼠巨噬細胞移動抑制因子的影響［J］.黑龍江醫學，2014，38（12）:1341-1343.

［8］馬艷梅.膿毒癥大鼠肺損傷時肺組織巨噬細胞移動抑制因子變化及丙酮酸乙酯的干預作用［J］.中華老年多器官疾病雜志，2009，8（2）:161-165.

［9］Brenner T，HoferS，Rosenhagen C，et al.Macrophage migration inhibitory factor（MIF）and manganese superoxide dismutase（Mn SOD）as early predictors for survival in patients with severe sepsis or septic shock［J］.J Surg Res，2010，164（1）:163-171.

［10］Chuang TY，Chang HT.High levels of serum macrophage migration inhibitory factor and interleukin 10 are associated with a rapidly fatal outcome in patients with severe sepsis［J］.Int J Infect Dis，2014，20（3）:13-17.

［11］Ohkawara T.Lack of macrophage migration inhibitory factor suppresses innate immune response in murine dextran sulfate sodiuminduced colitis［J］.Scand J Gastroenterol，2008，43（12）:1497-1504.

［12］Tohyama S.A novel DNA vaccine-targeting macrophage migration inhibitory factor improves the survival of mice with sepsis［J］.Gene Ther，2008，15（23）:1513-1522.

［13］張振輝，林珮儀，陳曉輝，等.膿毒癥小鼠心和腎組織中巨噬細胞移動抑制因子的表達［J］.中國急診醫學雜志，2009，18（11）:1159-1162.