rh-bFGF對缺血再灌注損傷兔視網膜組織中Caspase表達的影響

邵宏超，葛嫣然，劉巖，蘇杰

（河北聯合大學附屬醫院，河北 唐山 063000）

缺血性視網膜在恢復血供后，視力未見提升反而進一步下降，這種視功能損傷是不可逆的，臨床上稱之為視網膜缺血再灌注損傷（RIRI）［1］。RIRI作為一個很常見的病理生理損傷過程，其損害機制是多方面的［2］，其中凋亡作為細胞死亡的主要形式之一備受關注，而半胱氨酸蛋白酶2（Caspase-2）、半胱氨酸蛋白酶3（Caspase-3）被認為是參與細胞凋亡的兩種重要凋亡因子。重組人堿性成纖維細胞生長因子（rh-bFGF）是利用基因工程技術，在大腸桿菌中表達、純化而獲得的一種細胞因子，具有誘導新生血管生成、組織損傷修復、保護并刺激神經元再生等作用［3，4］。目前已有實驗證實，玻璃體內注射成纖維細胞生長因子溶液，能夠對視網膜RIRI組織起到保護作用，但其具體保護機制仍不十分清楚。本研究觀察了rh-bFGF對RIRI兔視網膜組織中Caspase表達的影響，進一步討論rh-bFGF對RIRI發揮保護作用的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 雄性體健大耳白兔52只（本院動物中心購入），體質量（2.2 ±0.2）kg，外眼及眼底正常者納入試驗，動物飼養于相同生長環境，且均選取左眼為實驗眼。52只大耳白兔隨機分為A組（24只）、B組（24只）、C組（4只）。

1.2 主要試劑 rh-bFGF分裝試劑購于上海西塘生物科技有限公司，Caspase-2單克隆抗體、Caspase-3單克隆抗體購于武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 RIRI模型制備及rh-bFGF干預 A、B組均制備RIRI模型。A組實驗動物在建立RIRI模型初始時往玻璃體內注射2 μg的rh-bFGF溶液，B組注射同等劑量的生理鹽水。RIRI模型的建立采取前房加壓灌注法:兔耳緣靜脈給予1 g/L的烏拉坦5 mg/kg注射麻醉，同時兔眼眼表滴用0.4%奧布卡因表麻。麻醉滿意后固定于操作臺上，呈俯臥位，均選取左眼造模，A、B組給予復方托吡卡胺滴眼液滴眼，散瞳后將5號頭皮針從兔耳前方角鞏膜緣處穿刺入前房，頭皮針另一端連接生理鹽水輸液瓶，緩慢勻速提升輸液瓶高度使其產生16.7 kP壓力［5］。視網膜中央動脈血供中斷標準:球結膜、虹膜顏色變蒼白，視網膜明顯水腫且呈蒼白色。前房灌注維持60 min，之后逐漸降低輸液瓶高度至動物眼水平，此時球結膜動脈血流恢復，虹膜顏色恢復正常，視網膜血供恢復橘紅色，缺血再灌注模型造模成功［6］。C組散瞳后，僅行前房穿刺操作，不做其他特殊處理。

1.4 視網膜組織病理學變化及 Caspase-2、Caspase-3表達檢測 C組動物處死并摘除眼球，A、B 組于制模后 1、6、12、24、48、72 h 分別各處死 4 只動物并摘除眼球，眼球標本制作石蠟切片后用于HE染色及免疫組化染色。視網膜組織病理學變化:烘干切片，脫蠟，乙醇復水，每個濃度2 min。蘇木素染色，0.5%鹽酸乙醇分化，1%氨水泛藍，1%伊紅染色，之后乙醇脫水，每個濃度2 min，二甲苯透明，中性樹膠封片。光學顯微鏡下觀察兔視網膜各層組織結構變化。Caspase-2、Caspase-3表達:采用SABC免疫組化法。切片常規脫蠟至水，然后加入H2O2滅活內源性酶，再加入山羊血清封閉液。之后順次加入一抗、生物素化二抗，SABC，DAB顯色，蘇木素輕度復染，脫水，透明，封片。顯微鏡下觀察。每只眼球隨機取4張切片，每張切片隨機取4個視野，由各視野的陽性細胞數算出平均值。

1.5 統計學方法 采用SPSS18.0統計軟件。計量資料以±s表示，比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組兔視網膜組織病理學變化 C組兔視網膜層次分明、結構規整，視細胞層、雙極細胞層、神經節細胞層（RGC）的細胞核平行排列，RGC呈卵圓形，為單層排列，位于內界膜外側，無空泡變性;內核層與外核層的細胞有多層細胞核，每一層細胞核之間呈緊密、規則排列，與內、外叢狀層分界清楚。B組兔視網膜出現明顯水腫，視網膜各層細胞排列疏松，細胞之間空隙增大，同時發現RGC和內核層細胞出現空泡樣變性，神經節細胞數目較前減少，內核層細胞數也出現下降，神經纖維層和內叢狀層出現腫脹且較正常組織有所增厚，細胞層次排列紊亂伴大量丟失。A組各層組織損害有著與B組相同的變化趨勢，但各層視網膜細胞損害程度較B組輕。

2.2 各組制模后不同時點兔視網膜組織中Caspase-2、Caspase-3表達比較 結果見表1。

表1 各組制模后不同時點兔視網膜組織中Caspase-2、Caspase-3 表達比較（±s）

表1 各組制模后不同時點兔視網膜組織中Caspase-2、Caspase-3 表達比較（±s）

注:與B 組比較，*P ＜0.05;與A、B 組比較，＊＊P ＜0.01;與同組1 h比較，△P＜0.05;與同組6 h比較，▲P ＜0.05;與同組 12 h比較，☆P＜0.05;與同組24 h比較，★P ＜0.05;與同組48 h比較，○P＜0.05。

組別 n Caspase-2 Caspase-3 A組4 1 h 0.087 ±0.005 0.086 ±0.019 6 h 0.426 ±0.061＊△ 0.198 ±0.041＊△12 h 0.712 ±0.086＊△▲ 0.895 ±0.076＊△▲24 h 1.398±0.091＊△▲☆ 1.898±0.054＊△▲☆48 h 1.135±0.064＊△▲☆★ 1.631±0.081＊△▲☆★72 h 0.342±0.103＊△☆★○ 0.977±0.093＊△▲★○B組 4 1 h 0.098 ±0.011 0.107 ±0.013 6 h 0.588 ±0.065△ 0.602 ±0.071△12 h 1.327 ±0.062△▲ 1.815 ±0.086△▲24 h 2.897 ±0.102△▲☆ 3.690 ±0.139△▲☆48 h 2.132±0.088△▲☆★ 2.521±0.071△▲☆★72 h 1.022±0.056△▲☆★○ 1.339±0.089△▲☆★○C組 4 0＊＊ 0＊＊

3 討論

研究發現，RIRI是通過誘導RGC發生的凋亡，從而導致不可逆性損害。視網膜急性缺血性疾病經過治療后，視網膜細胞在缺血損傷后再次進行再灌注，之后不僅未能挽救視功能反而會加重視功能的損害，引起視網膜損傷，并進一步導致細胞死亡。因此，進一步討論RIRI的發病機制以及便捷、高效的治療方法對臨床治療此類疾病非常重要。

近年研究［7］發現RIRI后神經節細胞死亡的主要形式之一是凋亡。Caspases是一種IL-1β轉化酶樣蛋白酶，同時它也是一個大家族，目前已知其下至少包含14個成員種類［8］。當Caspase家族中的某一個成員激活時，均會引發家族中其他成員的連鎖反應，進而將Caspases激活，被激活的Caspase作用于不同底物，各種底物在其作用下最終出現細胞凋亡的過程。因此，Caspases也被人們稱為細胞凋亡執 行 者［9，10］。 目 前 認 為，在 Caspase 家 族 中Caspase-2、Caspase-3與細胞凋亡存在最為緊密的聯系［11，12］。

Caspase-2最初被命名為Nedd-2/Ich-1，它具有啟始Caspases的長結構域。活化的Caspases-2可以通過直接或間接的途徑，經過酶切Bid（一種促調亡的bcl-2蛋白）的誘發，最終導致線粒體中凋亡相關蛋白釋放，并呈劑量依賴關系。大量研究發現，由Caspases家族成員介導的細胞凋亡是一個繁瑣的過程，其中成員之一的Caspases-2又在此復雜過程中發揮至關重要的作用。Caspases-2在Caspases家族中起兩種作用:①Caspase-2可激活下游的Caspases，起到傳導信號的作用。有實驗表明，Caspase-2可正向激活 Caspase-3，而 Caspase-3又可反向激活Caspase-2，這樣二者形成一個環狀反饋，進而促進Caspases家族的級聯反應;②Caspase-2可直接裂解蛋白，導致細胞凋亡。

Caspase-3又稱為半胱氨酸蛋白酶32，其基因是1994年 Fernandes-Alnemri等利用 RT-PCR技術從T淋巴細胞文庫中篩選出，Nicholson等在凋亡細胞中分離提純出來的一種蛋白酶。在未發生細胞凋亡時，Caspase-3以無活性的前Caspase-3形式存在，當細胞發生凋亡時則變為有活性的Caspase-3，有活性Caspase-3可進一步使組成細胞的重要蛋白質降解失活。因此，作為細胞凋亡蛋白酶級聯反應的重要一環，Caspase-3是目前探討細胞凋亡的熱點。

rh-bFGF是成纖維細胞生長因子家族的一種，它同時擁有多種生物學活性［13］。rh-bFGF可直接刺激成纖維細胞和細胞外基質蛋白質的有效結合，形成膠原纖維;還可與相應受體結合，通過誘導相關內皮細胞遷移，進而促進毛細血管的增生，最終形成膠原纖維［14］;同時可使血管細胞迅速增殖，改善局部微循環和組織的營養狀況［15］。本研究顯示，A組兔視網膜組織在水腫程度、空泡變形和核固縮方面均較B組有不同程度改善，Caspase-2、Caspase-3也較B組下降。由此我們推論，視網膜RIRI后玻璃體腔內注入 rh-bFGF，可通過下調凋亡基因 Caspase-2、Caspase-3的陽性表達，從而達到減少神經細胞凋亡數量的效果，這可能是rh-bFGF治療RIRI的作用機制之一。

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