psm－mec在臨床分離表皮葡萄球菌中的分布和表達

楊永長，肖代雯，姜 偉，陳 亮，胡洪華，周 薇，黃文芳

四川省醫學科學院·四川省人民醫院 檢驗科（成都 610072）

表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis，S.epidermidis）是人體皮膚正常菌，也是引起院內感染常見致病菌。當S.epidermidis在醫療設施中形成生物被膜后，可引起慢性感染和導管相關性感染，難以治愈，已引起醫學界廣泛關注［1－6］。 但S.epidermidis生物被膜形成的分子機制尚不完全清楚。近年來，國外學者［7－9］研究發現，葡萄球菌染色體mec基因盒（staphyloccoccal cassette chromosome mec，SCCmec）伴隨基因psm－mec能調節耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin resistant Staphylococcus aureus，MRSA）生物被膜形成，在具有生物被膜形成能力的S.epidermidis標準菌株RP62A培養上清存在PSM－mec多肽。前期預實驗結果顯示攜帶psm－mec基因的耐甲氧西林表皮葡萄球菌（methicillin resistant Staphylococcus epidermidis，MRSE）具有生物被膜形成能力，提示psmmec基因可能與MRSE生物被膜相關，但缺乏psmmec在臨床分離S.epidermidis中分布和表達的實驗證據。本研究采用分子生物學技術探討psm－mec在臨床分離S.epidermidis中的分布和表達，為深入分析其功能提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

165 株S.epidermidis來自2012年3月至2014年3月四川省人民醫院住院患者分離的非重復菌株，所有菌株均采用全自動微生物鑒定系統鑒定，其中血液分離138株，痰液分離15株，中段尿液分離5株，傷口分泌物分離7株。S.epidermidis標準菌株ATCC12228為本實驗室保存菌株。

1.2 試劑與儀器

細菌 DNA提取試劑（廣州達安）；2×Taq Master Mix、Ultra SYBR Mixture 、TRIzon 總RNA提取試劑、HiFi－HMMV逆轉錄試劑（北京康為世紀）；100bp DNA Ladder（北京天根）；LA Taq高保真DNA聚合酶、dNTPs、10×LA Taq BufferⅡ（TaKaRa）；血平板（鄭州安圖生物）；瓊脂糖（Biowest）；Tris堿（Novon）；PCR擴增儀PTC－200、凝膠成像儀（Bio－Rad）；熒光定量 PCR 儀7500（ABI）；生物安全柜、細胞培養箱（Heal Force）；電泳儀（Sanvant）；紫外分光光度計、高速低溫離心機（Eppendorf）；esp，mecA，psm－mec，fudoh 和 p221片段擴增的引物由上海Invitrogen公司合成。

1.3 細菌培養與基因組DNA提取

接種單個菌落至3mL LB液體培養基，37℃220r/min培養過夜。取1mL菌液，離心收集細菌，棄上清。沉淀加入100μL DNA提取液，100℃10min，以10 000r/min離心 5min，離心半徑9.5cm，上清即為S.epidermidis DNA，－20℃保存備用。

1.4 PCR擴增esp和mecA

根據文獻［10］，采用PCR擴增esp和mecA 進一步區分MRSE和甲氧西林敏感表皮葡萄球菌（methicillin susceptible Staphylococcus epidermidis，MSSE）。

1.5 擴增psm－mec、fudoh和p221基因片段

通過擴增psm－mec、fudoh和p221片段（圖1）鑒定攜帶psm－mec MRSE菌株。psm－mec引物序列、反應體系和擴增條件參考前期研究方法進行［10］。fudoh基因位于SCCmec上，序列包含psmmec全長及其上下游區域，fudoh基因擴增引物序列F：5′－CAATTCACTTGTCTTAAACTTTGTAGA AAAAGAAG－3′，R：5′－TATTTTATTTTCCATA ATTGCCTACCCCATAAG －3′，產物大小為530bp。反應體系：2×Taq Master Mix 10μL，上、下游引物各1μL，DNA 2μL，ddH2O 6μL。反應條件：95℃預變性3min，95℃變性30s，48℃退火30s，72℃延伸30s，30個循環，最后72℃延伸5min。p221引 物 序 列 F：5′－CGGGATCCTTTTTCAAATTT TTGACATTTATGC－3′，R：5′－CGGAATTCTTA ACCGAAAGCCTGAATGCAAGTC－3′，產 物 大 小為237bp。反應體系：2×Taq Master Mix 15μL，上、下游引物各1μL，DNA 2μL，ddH2O 11μL。反應條件：95℃預變性3min，95℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，30個循環，最后72℃延伸5min。產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后Bio－Rad凝膠成像儀檢測，根據臨床分離菌株psm－mec、fudoh和p221片段檢測結果鑒定攜帶psm－mec MRSE。

圖1 psm－mec和fudoh基因以及p221片段關系圖

1.6 psm－mec基因及其上游序列分析

采用如上所述的方法擴增fudoh基因片段，陽性結果送Invitrogen公司測序，通過NCBI Blast比對軟件進行序列分析。

1.7 psm－mec基因在臨床分離MRSE中的表達

1.7.1 細菌總RNA的提取 單菌落接種LB液體培養基，37℃220r/min振蕩培養至對數生長期，收集約1.5mL菌液于1.5mL Eppendorf管中，以9 700r/min離心2min，離心半徑9.5cm，去上清。沉淀加入1mL TRIzon總RNA提取試劑，反復吹打幾次，使細菌充分裂解，室溫放置5min，使蛋白核酸復合物完全分離。溶液中加入200μL氯仿，劇烈振蕩15s，室溫放置2～3min。4℃，以10 630r/min離心15min，離心半徑9.5cm，室溫靜置2～3min，此時液體分成3層（紅色有機相，中間和上層無色水相，RNA主要在水相中）。小心吸取上層水相（切勿吸到中間層）加入新Eppendorf管中，加入等體積的冷凍異丙醇，將樣品上下顛倒混勻，室溫放置10min，4℃，以10 630r/min離心10min，離心半徑9.5cm，去上清。加入1mL 75%乙醇溶液，渦旋混勻洗滌沉淀，4℃，以8 400r/min離心5min，離心半徑9.5cm，去上清。將樣品置于超凈臺中高風速吹干，大約30min。用經過預處理無RNase水溶解，總RNA進行分裝，－80℃保存備用。

1.7.2 cDNA合成 以細菌總RNA為模板，采用HiFi逆轉錄試劑進行cDNA合成，反應體系為20μL：HiFi－MMLV（200U/μL）1μL，5×RT Buffer 4μL，dNTP Mix（2.5mmol/L）4μL，Primer Mix 2μL，RNA template 2μL，DTT（0.1mol/L）2μL，RNase－free water 5μL。42℃孵育50min，70℃孵育15min。反應結束后，以7 520r/min離心1min，離心半徑9.5cm，置冰上冷卻備用。

1.7.3 psm－mec 定量標準品制備 擴增含psmmec序列的p221序列，將其克隆至穿梭質粒pLI50，構建p221重組質粒，經過酶切證實為p221片段后大量制備質粒并保存質粒菌落。堿裂解法提取質粒，分光光度法測質粒含量，根據質粒含量和長度計算獲得質粒拷貝數。用無RNase水稀釋5個濃度梯度作為psm－mec定量的標準品。

1.7.4 實時熒光定量逆轉錄PCR 按照試劑盒說明書進行。定量PCR在Applied Biosystems Real－Time PCR System（ABI 7500）中進行。反應體系為20μL，2×Ultra SYBR Mixture 10μL，上、下游引物（1μmol/L）各0.5μL，cDNA 2μL，RNasefree water 7μL。定量PCR反應條件為95℃預變性10min，95℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸32s，共40個循環，同時設5個濃度梯度標準品、陰性和陽性對照。根據標準曲線對目的基因進行定量分析。

2 結果

2.1 臨床分離S.epidermidis以MRSE為主

PCR擴增產物電泳結果顯示，165株臨床分離細菌均可擴增出esp基因片段，說明這些菌株均為S.epidermidis，與臨床微生物學鑒定相符。mecA陽性138株，mecA陰性27株。提示MRSE占臨床分離S.epidermidis的83.64%。

2.2 psm－mec僅分布于 MRSE中

165 株臨床分離S.epidermidis中有29株可擴增出psm－mec、fudoh基因和p221片段，攜帶率為17.58%；進一步分析發現，所有psm－mec陽性標本均為MRSE，而27株 MSSE中未擴增出psm－mec基因，提示psm－mec基因僅存在于 MRSE中（圖2和圖3）。

圖2 psm－mec基因在臨床分離S.epidermidis中的分布

2.3 psm－mec基因及其上游序列分析

29株psm－mec陽性MRSE均擴增出fudoh基因，測序結果經Blast比對顯示，29株psm－mec基因編碼序列與數據庫完全匹配，表明所有菌株的psmmec基因編碼序列無突變位點存在。而其中6株MRSE在psm－mec上游－12處發現單堿基突變（G＞A）（表1）。

表1 臨床分離MRSE菌株psm－mec基因突變分析

2.4 psm－mec在MRSE中的表達量檢測

為了探討psm－mec在MRSE中的表達，首先我們構建了含psm－mec的質粒p221，提取質粒后對其進行定量，并計算出其相應的拷貝數，然后將其進行系列梯度稀釋，通過SYBR熒光染料法進行PCR擴增，獲得擴增曲線，調節基線和閾值，得到標準曲線（圖4）。5個濃度梯度獲得標準曲線的相關系數為0.997，斜率為－3.27，截距為47.86，提示建立的SYBR熒光定量PCR可對psm－mec基因的表達進行定量分析。

圖4 定量PCR檢測psm－mec表達量的標準曲線

提取20個psm－mec陽性MRSE的總RNA，通過逆轉錄獲得cDNA，運用上述的SYBR熒光定量PCR方法對臨床分離MRSE的psm－mec進行定量分析。通過分析發現，所有標本均有psm－mec表達，其表達量在103～107拷貝之間。進一步分析G＞A點突變株與野生株之間psm－mec轉錄水平的差異，結果顯示突變株和野生株之間psm－mec的表達無明顯差異，提示G＞A點突變不影響psm－mec基因轉錄（圖5）。

圖5 臨床分離psm－mec陽性MRSE菌株的psm－mec基因表達情況

3 討論

定植人體皮膚表面的S.epidermidis是一種重要的院內感染條件致病菌，免疫抑制患者中大部分慢性感染和導管相關感染均由S.epidermidis引起［1］。在美國，22%ICU 患者的血流感染和13%人造瓣膜心內膜炎歸咎于S.epidermidis，每年用于治療S.epidermidis感染的費用高達20億美元左右［2］。我國一項涉及15個城市、17家醫院的調查顯示，80%以上臨床分離S.epidermidis為MRSE［3］。近年來，MRSE的檢出率越來越高，已成為全球院內感染的重要病原菌［4－5］。

生物被膜形成是S.epidermidis的主要致病機制［6］，其分子機制尚不完全清楚。研究［7］發現，可移動SCCmec上存在一種具有調節MRSA生物被膜的新基因psm－mec，該基因只存在院內感染MRSA中，而在社區獲得性MRSA中尚未發現此基因。由于MRSA的SCCmec可能來源于MRSE，因此我們設想院內感染分離的臨床MRSE菌株可能也攜帶psm－mec基因。本研究收集了165株臨床分離S.epidermidis，通過微生物學和分子生物學區分MRSE和MSSE，由于fudoh基因和p221片段覆蓋psm－mec序列全長及其上游區域［8］，我們通過PCR擴增psm－mec、fudoh基因和p221片段證實165株臨床分離S.epidermidis中，攜帶psm－mec基因的菌株為29株，在MRSE中占17.58%，高于MRSA中10%左右的攜帶率，提示psm－mec在臨床分離MRSE中存在更為普遍，對其在生物被膜形成過程中作用的研究更有意義。統計分析發現，psmmec僅分布于MRSE中。

為了研究psm－mec表達，我們構建了含有psmmec基因的重組質粒p221，并通過計算和梯度稀釋獲得熒光定量PCR檢測psm－mec標準品。提取攜帶psm－mec基因的MRSE細菌總RNA，逆轉錄后通過熒光定量PCR檢測發現，所有臨床分離的攜帶psm－mec基因的MRSE均表達此基因，說明這些攜帶菌株都表達psm－mec mRNA。

DNA序列分析顯示，在psm－mec ORF區域無堿基突變，且與數據庫序列完全一致，進一步證實psm－mec基因在 MRSE中的分布。同時少部分psm－mec存在－12G＞A點突變，與 MRSA中psmmec的突變模式（－7T＞C）不同［11］。在 MRSA中，psm－mec突變將導致毒力增加和生物被膜形成能力降低。我們推測在MRSA中psm－mec的突變可能抑制了其mRNA的表達，從而降低生物被膜形成能力。本研究通過熒光定量RT－PCR證實，－12G＞A點突變不影響psm－mec基因轉錄。

綜上所述，psm－mec僅分布和表達于部分臨床分離MRSE中，psm－mec上游－12G＞A點突變不影響psm－mec的表達，為探討psm－mec與生物被膜之間的關系及分子機制提供了依據。

［1］Otto M.Staphylococcus epidermidis—the ‘accidental′pathogen［J］.Nat Rev Microbiol，2009，7（8）：555－567.

［2］Rogers KL，Fey PD， Rupp ME.Coagulase－negative staphylococcal infections［J］.Infect Dis Clin North Am，2009，23（1）：73－98.

［3］Xiao YH，Wang J，Li Y，et al.Bacterial resistance surveillance in China：a report from Mohnarin 2004－2005［J］.Eur J Clin Microbiol Infect Dis，2008，27（8）：697－708.

［4］Raad I，Hanna H，Maki D.Intravascular catheter－related infections：advances in diagnosis，prevention，and management［J］.Lancet Infect Dis，2007，7（10）：645－657.

［5］Xu Z，Shi L，Alam MJ，et al.Integron－bearing methicillin－resistant coagulase－negative staphylococci in South China，2001－2004［J］.FEMS Microbiol Lett，2008，278（2）：223－230.

［6］Otto M.Molecular basis of Staphylococcus epidermidis infections［J］.Semin Immunopathol，2012，34（2）：201－214.

［7］Queck SY，Khan BA，Wang R，et al.Mobile genetic elementencoded cytolysin connects virulence to methicillin resistance in MRSA［J］.PLoS Pathog，2009，5（7）：1000533.

［8］Kaito C，Saito Y，Nagano G，et al.Transcription and translation products of the cytolysin gene psm－mec on the mobile genetic element SCCmec regulate Staphylococcus aureus virulence［J］.PLoS Pathog，2011，7（2）：1001267.

［9］Aoyagi T，Kaito C，Sekimizu K，et al.Impact of psm－mec in the mobile genetic element on the clinical characteristics and outcome of SCCmec－II methicillin－resistant Staphylococcus aureus bacteraemia in Japan［J］.Clin Microbiol Infect，2014，20（9）：912－919.

［10］楊永長，陳亮，肖代雯，等.攜帶psm－mec基因的耐甲氧西林表皮葡萄球菌產細菌生物膜的能力研究［J］.臨床檢驗雜志，2014，32（9）：700－702.

［11］Kaito C，Saito Y，Ikuo M，et al.Mobile genetic element SCCmec－encoded psm－mec RNA suppresses translation of agrA and attenuates MRSA virulence ［J］.PLoS Pathog，2013，9（4）：1003269.