七氟醚預處理對脊髓缺血再灌注大鼠5脂氧合酶表達的影響*

歐軍，趙紅，謝紅，姚平波，蘇小桃，何軍，何俊

（1.南華大學附屬南華醫院脊椎外科，湖南 衡陽 421002；2.南華大學護理學院基礎護理教研室，湖南，衡陽 421001）

·論著·

七氟醚預處理對脊髓缺血再灌注大鼠5脂氧合酶表達的影響*

歐軍1，趙紅2，謝紅1，姚平波1，蘇小桃1，何軍1，何俊1

（1.南華大學附屬南華醫院脊椎外科，湖南 衡陽 421002；2.南華大學護理學院基礎護理教研室，湖南，衡陽 421001）

目的探討七氟醚預處理對大鼠脊髓缺血再灌注損傷時5脂氧合酶（5-LOX）表達的影響。方法雄性成年SD大鼠45只，體重250～300 g，采用隨機數字表法，將大鼠隨機分為3組（n=15）：假手術組（S組）、脊髓缺血再灌注組（I/R組）和七氟醚預處理組（I組）。采用胸主動脈球囊阻斷+體循環低血壓法制備大鼠脊髓缺血再灌注模型。I組吸入3.4%七氟醚2 h，24 h后制備模型。于再灌注24 h時采用神經功能缺陷評分（NDS）法評價大鼠神經功能，隨后處死取脊髓，分別采用Western blot法和RT-PCR法測定5-LOX、p-ERK1/2和t-ERK1/2蛋白及其mRNA的表達水平。應用ELISA檢測血清中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的含量。結果與S組比較，I/R組和I組神經功能缺陷評分升高，I/R組5-LOX和p-ERK1/2蛋白及其mRNA表達上調，TNF-α含量升高，I組5-LOX mRNA和p-ERK1/2蛋白及其mRNA表達上調（P＜0.05）；與I/R組比05）。結論七氟醚預處理可能通過下調5-LOX表達，抑制ERK1/2信號通路，從而減輕大鼠脊髓缺血再灌注損傷。

生四烯酸鹽5-脂氧合酶；七氟醚；缺血預處理；再灌注損傷；脊髓

研究表明脊髓缺血再灌注損傷與炎癥因子的釋放、細胞內外離子紊亂、自由基及脂質過氧化、興奮性氨基酸及細胞凋亡蛋白的表達等密切相關。因此，針對脊髓再灌注損傷中神經細胞靶向藥物治療是挽救脊髓功能的關鍵點。與此同時，脊髓缺血再灌注損傷在嚴重創傷或術中發生出血性休克患者的臨床病理生理過程中發揮關鍵性的作用。因此，此類手術的麻醉藥選擇除了能達到滿意的麻醉療效外，還應具有脊髓保護作用[1-3]。七氟醚作為吸入性臨床常用的麻醉藥，在動物和細胞實驗研究均表明，七氟醚預處理可減輕脊髓缺血再灌注損傷[4-5]。5-脂氧合酶（5-lipoxygenase，5-LOX）是脂類信號分子生物合成過程中的關鍵酶，參與了脊髓缺血再灌注損傷的病理生理過程[6-8]。七氟醚預處理減輕脊髓缺血再灌注損傷的機制是否與5-LOX有關尚有待研究。本研究擬探討七氟醚預處理對大鼠脊髓缺血再灌注時5-LOX表達的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物

SPF級SD大鼠，雄性，體量250～300 g，由南華大學實驗動物部提供。

1.2主要試劑和儀器

RNA反轉錄試劑盒和SYBR試劑（瑞士羅氏公司），3.4%七氟醚（雅培制藥有限公司），實時熒光定量PCR儀（瑞士羅氏公司），蛋白提取試劑盒（廣州市銳博生物科技有限公司），p-ERK1/2、t-ERK1/2以及甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體（Santa Cruz，USA），ELISA試劑盒購自廣州市銳博生物科技有限公司。

1.3方法

1.3.1動物分組成年雄性SD大鼠45只，采用隨機數字表法，將大鼠隨機分為3組（n=15）：假手術組（S組）、脊髓缺血再灌注組（I/R組）和七氟醚預處理組（I組）。3組均為普通飼料飼養，自由飲水。1.3.2小鼠脊髓缺血再灌注損傷模型的建立腹腔注射4%水合氯醛0.1 mg/kg麻醉，智能恒溫控制儀維持大鼠體溫36～37℃；大鼠在特制喉鏡直視下行氣管插管，連接動物呼吸機行呼氣末正壓通氣，吸入氧濃度32%～34%，參考動脈血氣情況以維持pH值7.35～7.45、PaCO235～45 mmHg、PaO290～150 mmHg來調節呼吸頻率或潮氣量。采用充滿含肝素生理鹽水（IU/ml）的導管成功穿刺大鼠右頸內動脈和尾動脈并分別連接有創動脈血壓監測器，便于監測動脈血壓。右股動脈分離后，將頂端1.0～3.0 cm處有可充氣球囊的2 F微球囊導管從右股動脈切開處置入，逆行插入10.5 cm到達胸主動脈降部。頸內動脈導管與可加熱的血液收集循環裝置連接（裝置包括一個53.0 cm含肝素生理鹽水的垂直柱）。2 F微球囊導管用0.05 ml的生理鹽水膨脹阻塞動脈，當胸主動脈降部被阻塞的同時，開放右頸內動脈，動脈血可以回流進入肝素化柱內，維持前右頸內動脈均動脈壓于40 mmHg，尾動脈血壓降至6～7 mmHg時確認動脈阻塞完全。維持阻塞時間10 min，阻塞完成后將肝素化柱內的血液緩慢回輸入大鼠體內（時間＞1 min），在上述操作完成后所有大鼠均給予200 u的肝素鈉，并給予4 mg硫酸魚精蛋白，將2 F微球囊導管拔出，無菌外科縫合傷口，大鼠恢復自主呼吸后拔除氣管導管回籠。

I組大鼠先進行七氟醚預處理：自制有機玻璃箱，箱體一側靠近底部留有進氣口，另一側靠近頂部留有出氣口。進氣口處插入1根連接麻醉氣體揮發罐的管子并予以ULT-1工型麻醉氣體監測儀監測七氟醚的濃度，持續輸入含有3.4%七氟醚的氧氣，氣體流量為5 L/min；出氣口端連接ULT-1工型麻醉氣體監測儀監測七氟醚的濃度。在箱底放入適量鈉石灰，預充氣體，待出口氣體七氟醚濃度維持3.4%時，放入大鼠，吸入混合氣體2 h。預處理結束后24 h時制備大鼠脊髓缺血再灌注損傷模型。

1.3.3神經功能缺陷評分（neurological deficit scores，NDS）由2名專業人員（嚴格限制評分人員知曉實驗方法及預期療效）分別獨立進行，并于再灌注24 h時采用NDS評分法評價大鼠神經缺陷功能。Tarlov評分：0分：行走正常；1分：可行走，僅有輕度障礙；2分：后肢可支持體重，能行走1、2步；3分：不能負重，后肢活動頻繁或有力；4分：不能負重，但后肢可見活動；5分：不能負重，后肢無活動。翻身評分：0分：鼠背部放置后立即翻正；1分：不能翻正。位置評分：0分：當大鼠在空中時，后肢抓住突出物身體懸在空中；1分：不能懸在空中。斜板實驗：大鼠放置在測試面帶有淺溝槽的膠皮特制的斜板上，測量大鼠維持姿勢的能力、抓握能力和在斜板上至少停留5 s的最大角度并作為其功能值。每只大鼠測量3次，記錄分數最高者。正常大鼠在斜板上停留的最大角度為80°。綜合得分情況評定大鼠缺血再灌注后24 h時神經缺陷功能。

1.3.45-LOX、p-ERK1/2和t-ERK1/2的mRNA表達水平的檢測復制成功脊髓再灌注損傷的模型后24 h測定神經功能，每組缺血再灌注120 min后處死大鼠迅速取出L5～7段脊髓組織，置入液態氮中凍存備用。將其組織于RNA iso plus中研磨，氯仿抽提、75%乙醇沉淀組織內RNA，定量后反轉錄成cDNA。加入針對不同目標基因片段的引物，暗室內上樣后進行實時熒光定量PCR，分析曲線并作統計分析。以目標基因吸光度值與β-actin吸光度值的比值反映5-LOX、p-ERK1/2和t-ERK1/2的mRNA表達。

1.3.5Western blot法測定5-LOX、p-ERK1/2和t-ERK1/2蛋白的表達復制成功脊髓再灌注損傷的模型后24 h測定神經功能，每組缺血再灌注120 min后處死大鼠迅速取出L5～7段脊髓組織，依照說明書提取蛋白并測定其濃度。加預冷蛋白提取液稀釋于-70℃冰箱保存。相應濃度和等量的樣品蛋白經SDS-PAGE電泳后轉膜，按次序加入相應的一抗及二抗進行免疫性反應，DAB染色反應，膜晾干后拍照，蛋白條帶密度的定量分析運用凝膠圖像Image J軟件分析目標蛋白條帶灰度值，以其與內參GAPDH灰度值的比值反映各物質的表達水平。

1.3.6腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）的檢測應用ELISA檢測3組血清中TNF-α的含量，操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行。

1.4統計學方法

2 結果

與S組比較，I/R組5-LOX和p-ERK1/2蛋白及其mRNA表達上調，且NDS評分及血清TNF-α水平升高，I組5-LOX mRNA和p-ERK1/2蛋白及其mRNA表達上調（P＜0.05）；與I/R組比較，I組5-LOX和p-ERK1/2蛋白及其mRNA表達下調，且NDS評分及血清TNF-α水平降低（P＜0.05）。見附表和附圖。

附表3 組脊髓組織5-LOX、p-ERK1/2、t-ERK1/2和TNF-α的表達及NDS評分的比較（n=45，x±s）

附圖 各組5-LOX和p-ERK1/2蛋白的檢測

3 討論

研究證實，缺血再灌注損傷后24 h Beclin 1及LC3蛋白等自噬基因水平高，故本研究以此為研究時點[4]。結果表明，大鼠脊髓缺血再灌注時神經功能缺陷評分升高，表明大鼠脊髓缺血再灌注損傷模型制備成功。本研究依照文獻的方法[9]進行七氟醚預處理，結果表明七氟醚預處理可降低缺血再灌注期間神經功能缺陷評分，表明七氟醚預處理減輕了大鼠脊髓缺血再灌注損傷。

本研究結果顯示，大鼠脊髓缺血再灌注期間5-LOX和p-ERK1/2蛋白及其mRNA表達明顯上調，七氟醚預處理后其表達明顯下調，表明七氟醚預處理可通過下調5-LOX表達，抑制ERK1/2信號通路，從而減輕大鼠脊髓缺血再灌注損傷。

脊髓缺血再灌注時，5-LOX激活蛋白首先活化，進而引起5-LOX表達上調。5-LOX表達上調可誘導p-ERK1/2表達和激活TNF-α，從而激活ERK1/2信號通路，釋放促炎細胞因子，導致炎性級聯反應，從而誘發脊髓損傷[10-11]。七氟醚下調5-LOX表達的具體機制尚待進一步研究。

綜上所述，七氟醚預處理可能通過下調5-LOX表達，抑制ERK1/2信號通路，從而減輕大鼠脊髓缺血再灌注損傷。

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（張立芳 編輯）

Effect of sevoflurane preconditioning on expression of 5-lipoxygenase during spinal cord ischemia-reperfusion in rats*

Jun OU1,Hong ZHAO1,Hong XIE1,Xiao-tao SU1,Jun HE1,Jun HE1
(1.Department of Spinal Surgery,Nanhua Hospital Affiliated to University of South China,Hengyang, Hunan 421002,P.R.China;2.Teaching and Research Office of Basic Nursing,the School of Nursing,University of South China,Hengyang,Hunan 421001,P.R.China)

【Objective】To investigate the effect of sevoflurane preconditioning on the expression of 5-lipoxygenase(5-LOX)during spinal cord ischemia-reperfusion(I/R)in rats.【Methods】Forty-five male adult Sprague-Dawley rats weighing 250～300g were randomly divided into 3 groups(n=15 each):sham operation group (group S);spinal cord I/R group(group I/R);sevoflurane preconditioning group(group I).The animals were anesthetized with intraperitoneal 4%chloral hydrate 0.1 mg/kg.Spinal cord ischemia was induced by 10 min occlusion of the thoracic aorta combined with controlled hypotension(MAP=40 mmHg).The rats inhaled 3.4% sevoflurane for 2 h and spinal cord I/R was produced 24 h later in group I.The neurological deficits were scored at 24 h of reperfusion.The animals were then sacrificed.The expression of 5-LOX,p-ERK1/2 and t-ERK1/2 protein and mRNA was detected using Western blot and RT-PCR respectively.TNF-α levels in serum were detected by ELISA.【Results】Compared with group S,the neurological deficit score and TNF-α levels in serum were significantly increased in groups I/R and I,the expression of 5-LOX and p-ERK1/2 protein and mRNA was up-regulated in group I/R,and the expression of 5-LOX mRNA and p-ERK1/2 protein and mRNA was up-regulated in group I(P<0.05).Compared with group I/R,the neurological deficit score was significantly lower,TNF-α levels in serum was lower,and the expression of 5-LOX and p-ERK1/2 protein and mRNA was lower in group I(P<0.05).【Conclusion】Sevoflurane preconditioning can reduce spinal cord I/R injury by down-regulating the expression of 5-LOX and inhibiting ERK1/2 signaling pathway in rats.

arachidonate 5-lipoxygenase;sevoflurane;ischemic preconditioning;reperfusion injury;spinal cord

R-332

A

1005-8982（2015）25-0012-04

2015-01-17

湖南省自然科學基金資助項目（No：2013FJ4212）；湖南省教育廳資助項目（No：14B157）