葛根復(fù)方對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無力大鼠血清RNS和AchR-Ab表達(dá)影響

文穎娟， 楊俊超

（陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西咸陽712046）

葛根復(fù)方對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無力大鼠血清RNS和AchR-Ab表達(dá)影響

文穎娟， 楊俊超

（陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西咸陽712046）

目的 研究葛根復(fù)方 （葛根、黃芪、丹參、蒼術(shù)、黃柏等）對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無力大鼠腓腸肌重復(fù)性神經(jīng)刺激電位（RNS）和乙酰膽堿受體抗體 （AchR-Ab）表達(dá)的影響，并探討其機(jī)制。方法 將100只Lewis大鼠隨機(jī)分為4組，除正常組，模型組、強(qiáng)的松組、葛根復(fù)方組采用皮下注射鼠源性AchR-α亞基97～116肽段方法建立重癥肌無力的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停炷３晒Φ膬山M分別給予強(qiáng)的松、葛根復(fù)方灌胃4周，觀察大鼠治療前后的RNS和AchR-Ab的變化。結(jié)果 治療前與正常組比較，造模各組大鼠的RNS都有明顯衰減；治療后與模型組比較，強(qiáng)的松組和葛根復(fù)方組的RNS衰減程度都減弱；治療后與強(qiáng)的松組比較，葛根復(fù)方組的RNS衰減程度明顯低。治療前造模各組大鼠的AchR-Ab表達(dá)水平明顯高于正常組（P＜0.01）；強(qiáng)的松組和葛根復(fù)方組治療后和模型組比較，兩組中AchR-Ab表達(dá)水平明顯下降 （P＜0.05）；治療后強(qiáng)的松和葛根復(fù)方組比較，葛根復(fù)方組的AchR-Ab表達(dá)水平明顯偏低 （P＜0.05）。結(jié)論 葛根復(fù)方能促進(jìn)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無力大鼠腓腸肌的肌力恢復(fù)。

實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無力；葛根復(fù)方；重復(fù)性電極刺激電位 （RNS）；乙酰膽堿受體抗體 （AchR-Ab）

One hundred Lewis rats were random ly and equally divided into four groups，except the control group，rats in other three groups，including themodel，Compound Gegen Decoction and Prednisone groups，were immunized with rat-derived 97-116 peptide of the AchRα-subunit.After the EAMGmodelwas successfullymade，the rats in two groupswere administered with Prednisone and Compound Gegen Decoction for fourweeks.The changes of RNSand AchR-Ab were observed in each group before and after treatment.RESULTS As compared with the control group before the treatment，RNS level in model rats decreased more.As compared with themodel group after the treatment，RNS recession level in Prednisone and Compound Gegen Decoction groups showed more recoveries，but the latter was inferior to the former.As compared with the control group before the treatment，AchR-Ab level inmodel rats was obviously higher（P＜0.01）.After the treatment，AchR-Ab level in Compound Gegen Decoction and Prescription groups showed markedly lower（P＜0.05），but the former was less than the latter（P＜0.05）.

CONCLUSION Compound Gegen Decoction can promote the improvement of muscle strength in rats with

EAMG.

重癥肌無力（myasthenia gravis，MG）是一種常見的神經(jīng)科疑難病之一，其病變部位主要在神經(jīng)肌肉接頭突觸上，是由乙酰膽堿受體參與的自身免疫性疾病［1］。據(jù)報(bào)道MG患病率為 （77～150）/ 100萬，年發(fā)病率為 （4～11） /1萬［2］，發(fā)病人群多集中于10歲以下兒童或50歲以上老人［3-4］。本實(shí)驗(yàn)通過觀察葛根復(fù)方對(duì)重癥肌無力大鼠的治療效果，研究中藥對(duì)腓腸肌重復(fù)性神經(jīng)刺激電位和乙酰膽堿受體抗體的影響，以期能進(jìn)一步探討重癥肌無力的致病機(jī)理。

1 材料與儀器

1.1 藥物 葛根復(fù)方 （葛根20 g，黃芪15 g，丹參15 g，蒼術(shù)15 g，黃柏15 g，牛膝15 g，薏仁15 g），復(fù)方組成及藥物用量參考 《方劑學(xué)》［5］及 《中藥學(xué)》［6］。藥物購買于陜西中醫(yī)學(xué)院藥房，藥物質(zhì)量濃度按要求濃縮。大鼠用量參照 《現(xiàn)代醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)》［7］，為臨床用量的 6.25倍。強(qiáng)的松（浙江仙琚制藥股份有限公司，生產(chǎn)批號(hào)國藥準(zhǔn)字H33021207）配置為0.54 mg/m L質(zhì)量濃度的混懸液。

1.2 動(dòng)物 Lewis大鼠100只，雌性，8周齡大，SPF級(jí)，體質(zhì)量160～180 g，平均 （167.56± 13.34）g，動(dòng)物來自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證編號(hào)SCXK（陜）2013—001。隨機(jī)將動(dòng)物分為4組，分別為：正常組、模型組、強(qiáng)的松組、葛根復(fù)方組，每組25只。

1.3 試劑與儀器 鼠源性AchRα亞基97～116肽段（rat-derived 97～116 peptide of the AchRα-subunit），購自南京金斯瑞生物科技有限公司。完全弗氏佐劑 （CFA），不完全弗氏佐劑 （IFA），磷酸緩沖鹽 （PBS），0.2%的羧甲基纖維素鈉，氨水，乙醇，生理鹽水，水合氯醛，酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定試劑（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA），PowerLab數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)（PowerLab data recording&analysis system）由上海埃德儀器國際貿(mào)易有限公司提供。

2 方法

2.1 造模 除正常組外，模型組、強(qiáng)的松組、葛根復(fù)方組均給予兩次免疫處理進(jìn)行造模。配置200μL含有100μg鼠源性AchRα亞基97～116肽段的CFA和PBS的混合乳液，于大鼠四肢足墊和腹部皮下注射，正常組注射等量PBS。30 d后進(jìn)行第二次加強(qiáng)免疫，將200μL含有50μg鼠源性AchRα亞基97～116肽段的IFA和PBS混合乳液同樣皮下注射。

2.2 給藥 造模成功的75只大鼠 （造模成功率為100%）進(jìn)行治療。強(qiáng)的松組劑量5.4 mg/（kg.d），葛根復(fù)方組劑量11.46 g/（kg.d），大鼠給藥體積為10 mL/kg，連續(xù)灌胃治療4周。

3 指標(biāo)檢測(cè)

3.1 體質(zhì)量的觀察 初次免疫之后，記錄大鼠飲食、飲水、體質(zhì)量變化情況。

3.2 肌力的測(cè)定 在末次免疫出現(xiàn)明顯肌無力癥狀后采用Lennon［8］的肌力評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分。0分，無明顯無力表現(xiàn)；1分，爬動(dòng)無力或叫聲減少；2分，明顯無力，前肢屈曲，躬背低頭，被捉時(shí)掙扎；3分，嚴(yán)重全身無力，沒有叫聲或爬動(dòng)，呈瀕死狀態(tài)。介于四者之間者打0.5、1.5、2.5分。

3.3 肌電圖檢測(cè) 明顯肌無力癥狀出現(xiàn)后，麻醉大鼠，采用生物電信號(hào)20μV，3、5、10 Hz低頻給予刺激，刺激電極插入坐骨神經(jīng)附近肌肉處，記錄電極插入同側(cè)腓腸肌處，參考電極插入腹部皮下，繼續(xù)記錄5 s，觀察衰減程度。

3.4 AchR-Ab檢測(cè) 治療前后，均靜脈采血，用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測(cè)定。

3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 13.0作為統(tǒng)計(jì)工具，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用表示，采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析 （one-way ANOVA），以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

4 結(jié)果

4.1 大鼠體質(zhì)量的變化 第0周，造模前，各組大鼠的體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）；第4周，第一次造模結(jié)束，各造模組大鼠的體質(zhì)量增長速度開始減緩，各造模組大鼠體重量差異無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （P＞0.05）；第6周，第二次造模結(jié)束，各造模組大鼠的體質(zhì)量明顯低于正常組大鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05），各造模組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）；第10周，藥物治療結(jié)束后，葛根復(fù)方組和強(qiáng)的松組的體質(zhì)量增長速度又有所增加，但模型組大鼠體質(zhì)量未見增加，甚至出現(xiàn)負(fù)增長，葛根復(fù)方組和強(qiáng)的松組大鼠

體質(zhì)量要明顯高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；葛根復(fù)方組大鼠的體質(zhì)量和強(qiáng)的松組比較，葛根復(fù)方組明顯高于強(qiáng)的松組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）。結(jié)果見表1。

表1 葛根復(fù)方對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響Tab.1 Effects of Com pound Gegen Decoction on the body weights of Lew is rats

表1 葛根復(fù)方對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響Tab.1 Effects of Com pound Gegen Decoction on the body weights of Lew is rats

注：與正常組比較，△P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與強(qiáng)的松組比較，●P＜0.05

組別 第0周體質(zhì)量/g 第4周體質(zhì)量/g 第6周體質(zhì)量/g 第10周體質(zhì)量/g正常組模型組強(qiáng)的松組葛根復(fù)方組168.56±13.35 170.21±14.52 172.14±15.25 174.31±14.72 227.64±2.14 214.53±3.69 220.62±5.83 219.25±2.66 266.43±3.23 227.11±2.34△235.34±2.13△232.19±4.53△300.23±3.46 227.75±4.42 270.12±3.38*288.47±3.64**●

4.2 Lennon肌力評(píng)定 免疫加強(qiáng)后大鼠出現(xiàn)叫聲低弱，反應(yīng)遲鈍，活動(dòng)量明顯減少，毛發(fā)干枯發(fā)暗，蜷縮弓背癥狀，肌無力比較明顯，按照Lennon肌力評(píng)價(jià)方法給予評(píng)分，結(jié)果顯示治療前模型制備各組老鼠與正常組比較，肌無力癥狀明顯，統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著差異 （P＜0.05），各模型制備組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）。治療一月結(jié)束后，葛根復(fù)方組和強(qiáng)的松組的肌無力癥狀明顯改善，和模型組比較評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）；葛根復(fù)方組的肌力改善情況優(yōu)于強(qiáng)的松組，兩組評(píng)分比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）。結(jié)果見表2。

表2 葛根復(fù)方治療前后大鼠的臨床Lennon評(píng)分比較Tab.2 Compound Gegen Decoction on the cIinicaI symptom s of the pre-therapeutic and post-therapeutic Lew is rats

表2 葛根復(fù)方治療前后大鼠的臨床Lennon評(píng)分比較Tab.2 Compound Gegen Decoction on the cIinicaI symptom s of the pre-therapeutic and post-therapeutic Lew is rats

注：與正常組比較，△P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與強(qiáng)的松組比較，●P＜0.05

組別 動(dòng)物數(shù) 治療前 治療后正常組25 0.0±0.0 0.0±0.0模型組 25 1.7±0.3△ 1.2±0.4強(qiáng)的松組 25 1.8±0.2△ 0.9±0.2*葛根復(fù)方組 25 1.5±0.5△ 0.5±0.3**●

4.3 肌電圖測(cè)定 治療前，大鼠在麻醉情況下，用3、5、10 Hz重復(fù)電刺激大鼠腓腸肌，截取20 μV/0.01 s，5 Hz視圖觀察，正常組大鼠肌電圖波幅無明顯變化，造模各組大鼠肌電圖波幅衰減程度均超過10%，造模各組和空白組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05），各造模組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）；治療后同樣方法測(cè)得強(qiáng)的松組大鼠和葛根復(fù)方組大鼠肌電圖波幅衰減程度都有所恢復(fù)，和模型組比較明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05），說明治療有效；治療后與強(qiáng)的松組比較，葛根復(fù)方組的肌電圖波幅衰減程度恢復(fù)更好，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05），說明葛根復(fù)方組的治療效果比強(qiáng)的松顯著。結(jié)果見表3、圖1、圖2。

表3 葛根復(fù)方治療前后大鼠的腓腸肌肌電平均振幅比較Tab.3 Com pound Gegen Decoction on eIectrom yography of gastrocnem ius of the pre-therapeutic and posttherapeutic Lewis rats

表3 葛根復(fù)方治療前后大鼠的腓腸肌肌電平均振幅比較Tab.3 Com pound Gegen Decoction on eIectrom yography of gastrocnem ius of the pre-therapeutic and posttherapeutic Lewis rats

注：與正常組比較，△P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與強(qiáng)的松組比較，●P＜0.05

組別 動(dòng)物數(shù) 治療前 治療后正常組25 19.7±1.3 19.3±1.0模型組 25 6.2±0.9△ 6.5±0.4強(qiáng)的松組 25 5.7±0.8△ 15.9±0.6*葛根復(fù)方組 25 5.5±0.5△ 17.7±0.7**●

4.4 AchR-Ab檢測(cè) 藥物治療前后分別檢測(cè)大鼠血液中AchR-Ab的量。治療前各造模組大鼠AchRAb的量與正常組比較明顯偏高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05），各造模組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）；藥物治療后，強(qiáng)的松組和葛根復(fù)方組大鼠AchR-Ab的量比起模型組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）；葛根復(fù)方組和強(qiáng)的松組比較，葛根復(fù)方組AchR-Ab的量較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）。結(jié)果見表4。

表4 葛根復(fù)方治療前后大鼠血清中AchR-Ab表達(dá)水平比較Tab.4 Com pound Gegen Decoction on the exp ressions of AchR-Ab in serum of the pre-therapeutic and posttherapeutic Lew is rats

表4 葛根復(fù)方治療前后大鼠血清中AchR-Ab表達(dá)水平比較Tab.4 Com pound Gegen Decoction on the exp ressions of AchR-Ab in serum of the pre-therapeutic and posttherapeutic Lew is rats

注：與正常組比較，△P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與強(qiáng)的松組比較，●P＜0.05

組別 動(dòng)物數(shù) 治療前 治療后正常組25 0.73±0.04 0.72±0.03模型組 25 6.13±0.43△ 6.25±0.49強(qiáng)的松組 25 6.18±0.35△ 3.32±0.12*葛根復(fù)方組 25 6.21±0.36△ 2.05±0.06**●

5 討論

圖1 治療前大鼠腓腸肌肌電圖Fig.1 EIetrom yogram s of gastrocnem ius of the pre-therapeu tic Lew is rats

圖2 治療后大鼠腓腸肌肌電圖Fig.2 EIetrom yogram s of gastrocnem ius of the post-therapeu tic Lew is rats

重癥肌無力作為一種自身免疫性疾病，其發(fā)病源于神經(jīng)肌肉接頭處 （NMJ）傳遞性功能障礙，NMJ突觸后膜上的AchR自身抗體介導(dǎo)的特異性自

身免疫阻斷了神經(jīng)信號(hào)的傳遞，產(chǎn)生了一系列的骨骼肌疲勞癥狀［9］。目前對(duì)重癥肌無力的治療大多采用膽堿抑制劑、免疫抑制劑等，主要通過抑制這種自身免疫反應(yīng)，恢復(fù)神經(jīng)肌肉信號(hào)傳播，來緩解肌無力癥狀。但是治療效果不佳，仍有待進(jìn)一步探討治療。

RNS檢查是目前最能反應(yīng)NMJ神經(jīng)電生理變化的檢查方法，由于神經(jīng)突觸受體自身免疫損傷，神經(jīng)沖動(dòng)信號(hào)的傳播受到影響，所以生理肌電的檢測(cè)結(jié)果可以反映出肌無力癥狀的輕重［10］。檢測(cè)時(shí)以波幅衰減率大于等于10%為陽性［11］，目前RNS衰減率已經(jīng)作為常用的診斷肌無力的方法，振幅衰減程度越大臨床表現(xiàn)肌無力癥狀越明顯。

乙酰膽堿受體抗體（AchR-Ab）是最早發(fā)現(xiàn)的MG患者檢測(cè)指標(biāo)之一，這種由自身受體病變而產(chǎn)生的阻斷性抗體在MG診斷當(dāng)中已經(jīng)作為一項(xiàng)最重要指標(biāo)，雖然目前顯示并非所有患者都會(huì)有血清抗體陽性反應(yīng)，但是大多數(shù)肌無力患者血清中抗體的數(shù)量越多，表現(xiàn)出的肌無力癥狀就越嚴(yán)重，其滴度的大小還和疾病的嚴(yán)重程度呈正向相關(guān)，因此抗體的檢測(cè)一直受到高度重視，也已經(jīng)建立了標(biāo)準(zhǔn)化的檢測(cè)方法，得到了廣泛的定性和定量的分析［12］。

近年來運(yùn)用中醫(yī)理論治療重癥肌無力已經(jīng)顯現(xiàn)出一定的優(yōu)勢(shì)。重癥肌無力在中醫(yī)中屬于 “痿證”范疇，發(fā)病機(jī)理主要為脾虛不運(yùn)，水濕停滯，瘀血阻滯，機(jī)體氣血運(yùn)行受阻，出現(xiàn)虛實(shí)夾雜的病證［13］。辨證治法應(yīng)以益氣健脾，清熱利濕，活血化瘀等治法為主。本研究選取葛根、黃芪、丹參、蒼術(shù)、黃柏、牛膝、薏仁的配伍來治療，以期通過健脾燥濕，活血通脈來改善肌無力癥狀。葛根入陽明經(jīng)，可通行氣血，輸肌活絡(luò)，解肌驅(qū)邪；黃芪入脾入肺，益氣健脾，氣充則健運(yùn)，氣行則脈通，瘀阻自可暢達(dá)；丹參入血入絡(luò)，可行氣活血，祛瘀生新，清熱涼血，疏通經(jīng)絡(luò)［14］；黃柏苦寒，苦能燥濕，寒以清熱，入下焦；蒼術(shù)辛、苦溫，辛發(fā)散祛風(fēng)，苦溫能燥濕；薏仁甘淡、性寒，健脾利濕除痹利筋絡(luò)；牛膝苦、性酸平，活血化瘀，引藥下行，補(bǔ)益肝腎利關(guān)節(jié)強(qiáng)筋骨。四味合用，為燥濕健脾，活血通絡(luò)，治濕熱痿證之妙劑［15］。全方以健脾益氣為主，兼可清熱利濕，活血通絡(luò)，正邪兼顧，攻補(bǔ)兼施，為治療因脾虛濕熱瘀阻而致肌無力的重要方。

本實(shí)驗(yàn)通過中藥復(fù)方治療實(shí)驗(yàn)性重癥肌無力大鼠，觀察肌無力大鼠體質(zhì)量的變化情況、肌力的變化情況和肌無力血清中相關(guān)因子AchR-Ab變化情況。結(jié)果顯示，葛根復(fù)方在治療肌無力大鼠中效果顯著，對(duì)大鼠體質(zhì)量、肌力恢復(fù)、血清中相關(guān)因子AchR-Ab的表達(dá)都有顯著改善。本研究說明中藥葛根復(fù)方配伍對(duì)肌無力大鼠的癥狀有明顯改善，顯示出了優(yōu)于西藥的治療效果，這將為中藥治療重癥肌無力提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為進(jìn)一步篩選有效的中醫(yī)藥方治療肌無力提供幫助。

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Effect of Compound Gegen Decoction on RNS and AchR-Ab in rat serum w ith experim entaIautoimm une myasthenia gravis

WEN Ying-juan， YANG Jun-chao

（Shanxi Gollege of Traditional Ghinese Medicine，Xianyang 712046，Ghina）

AIM To research the effect of Compound Gegen Decoction（Puerariae lobatae Radix，Astragali Radix，Salviaemiltiorrhizae Radix et Rhizoma，Atractylodis Rhizoma，Phellodendri chinensis Cortex，etc.）on gastrocnemius repetitive nerve stimulation（RNS）and the expression of acetylcholinereceptor antibodies（AchR-Ab）in rat serum with experimental autoimmunemyasthenia gravis（EAMG）and itsmechanism of action.METHODS

experimental autoimmune myasthenia gravis（EAMG）；Compound Gegen Decoction；repetitive nerve stimulation（RNS）；acetylcholine receptor antibodies（AchR-Ab）

R285.5

A

1001-1528（2015）11-2357-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.11.005

2014-10-09

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 （81202642）；陜西省重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目 （2014）

文穎娟 （1973—），女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)槠⑽覆∽C方藥。Tel：13609108884，E-mail：wenyuyao2003@ 163.com