白背三七總黃酮對2型糖尿病大鼠胰島素抵抗的影響

賀 克， 劉 姣， 劉麗華， 李彩霞， 王 康， 申曉日

（1.石家莊市第四醫院，河北石家莊050011；2.河北中醫學院實驗中心，河北石家莊050200）

白背三七總黃酮對2型糖尿病大鼠胰島素抵抗的影響

賀 克1， 劉 姣2*， 劉麗華1， 李彩霞1， 王 康2， 申曉日2

（1.石家莊市第四醫院，河北石家莊050011；2.河北中醫學院實驗中心，河北石家莊050200）

目的 觀察白背三七總黃酮對2型糖尿病大鼠胰島素抵抗的影響。方法 采用高糖高脂飼料喂養加腹腔注射鏈脲佐菌素 （STZ）的方法建立2型糖尿病胰島素抵抗模型。設空白組、模型組、陽性藥二甲雙胍組、白背三七總黃酮高劑量組、中劑量組及低劑量組，給藥6周后測各組大鼠糖耐量 （GTT），空腹血糖 （FPG）、糖化血紅蛋白 （GHb）和血清胰島素（FINS）水平，計算胰島素敏感指數（ISI）及胰島素抵抗指數（HOMA-IR），RT-PCR法檢測肝細胞膜胰島素受體 （InsR）mRNA表達。結果 高劑量及中劑量白背三七總黃酮組大鼠的糖耐量得到顯著改善 （P＜0.01），FPG、GHb、FINS及HOMA-IR水平顯著減少（P＜0.01），ISI水平顯著上升（P＜0.01），肝細胞膜InsR mRNA的表達顯著增強 （P＜0.05或P＜0.01）。結論 白背三七總黃酮能夠改善2型糖尿病大鼠胰島素抵抗，其作用機制可能與上調InsR mRNA的表達有關。

白背三七總黃酮；2型糖尿病；胰島素抵抗；胰島素受體

白背三七Gynura divaricata（L.）DC.又名白（百）子菜，來源于菊科菊三七屬植物白子菜，根、莖、葉均可入藥，其味甘、淡，性寒，具有清熱涼血、散痞消腫之功效，主要用于支氣管炎、肺結核、跌打損傷、外傷出血等［1-2］。近年來，民間有用白背三七治療糖尿病、高血脂及高血壓等病的情況，文獻中也可見白背三七降糖作用的相關報道［3-5］。在前期的研究中發現，白背三七提取物對胰島素抵抗 （IR）模型大鼠的空腹血糖 （FPG）、糖耐量（GTT）、糖化血紅蛋白 （GHb）及血清胰島素水平（FINS）均有降低作用。化學研究顯示，白背三七中主要含有黃酮、多糖等，其中黃酮類為降血糖的主要活性成分［4，6-7］。為進一步探討白背三七總黃酮對2型糖尿病IR的改善作用，并明確其作用機理，本研究采用高糖高脂飼料喂養加小劑量注射鏈脲佐菌素的方法復制2型糖尿病大鼠

模型，以白背三七總黃酮治療后，觀察大鼠FPG、GTT、GHb、FINS水平以及肝臟胰島素受體（InsR）mRNA表達的變化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 清潔級SD大鼠，雄性，體質量180～200 g，購自河北省實驗動物中心 （許可證號SYXK冀2006-0047），動物合格證號1305032。

1.1.2 藥物 取白背三七，粉碎后以乙醇回流提取，提取液濃縮后上大孔樹脂柱，以不同濃度乙醇洗脫，收集洗脫液，回收溶劑后即得白背三七總黃酮 （總黃酮的量為51.32%），由河北中醫學院實驗中心制備。鹽酸二甲雙胍片 （0.25 g/片，深圳市中聯制藥有限公司）。

1.1.3 試劑 鏈脲佐菌素（Streptozotocin，STZ，美國Sigma公司）；強生穩豪血糖試紙 （強生醫療器械有限公司）；糖化血紅蛋白試劑盒 （南京建成生物工程研究所）；RTPCR試劑盒（寶生物工程有限公司）；Trizol（美國Invitrogen公司）。

1.1.4 儀器 強生穩豪血糖儀 （強生醫療器械有限公司）；756MC型紫外-可見分光光度計 （上海精密科學儀器有限公司）；PE9600型PCR擴增儀（美國PE公司）；電泳儀及電泳槽 （北京六一儀器廠）；MDF-382E超低溫保存箱（日本SANYO公司）；1-15K高速冷凍離心機（美國Sigma公司）。

1.2 方法

1.2.1 高脂飼料的制備 高脂飼料的配方為：66.5%普通飼料、20%糖粉、10%豬油、2.5%膽固醇加1%膽酸鈉，由河北醫科大學實驗動物中心加工。

1.2.2 動物模型制備 60只SD大鼠，隨機分為空白組10只和造模組50只，分別給予常規飼料和高糖高脂飼料喂養。4周后，造模組大鼠腹腔注射STZ 50 mg/kg，空白組腹腔注射相同體積的枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液。2 d后，于鼠尾采血測量血糖值，空腹血糖＞10.0 mmol/L，即得2型糖尿病大鼠。

1.2.3 分組與給藥 選取造模成功的大鼠50只，按空腹血糖值隨機分組，分為2型糖尿病模型組、白背三七總黃酮高劑量組（120mg/kg）、中劑量組（60mg/kg）、低劑量組（30 mg/kg）及二甲雙胍陽性對照組（100 mg/kg）5組，每組10只。各給藥組大鼠按照每次1mL/100 g體質量的容量灌胃給藥，空白組及模型組大鼠給等體積蒸餾水，每日1次，連續6周。

1.2.4 標本采集 實驗結束后，大鼠禁食12 h，腹主動脈取血，離心分離血清。迅速取部分肝組織，于液氮中保存。

1.2.5 指標檢測

1.2.5.1 葡萄糖耐量試驗（GTT） 大鼠禁食12 h，灌胃2 g/kg葡萄糖，0、30、120min分別尾部取血，用血糖儀測定血糖值，并計算血糖-時間曲線下面積 （AUC）以表示糖耐量。0.25×（0 h血糖值+4×0.5 h血糖值 +3×2 h血糖值）1.2.5.2 測定空腹血糖 （FPG）、糖化血紅蛋白 （GHb）及空腹血清胰島素水平 （FINS），計算胰島素敏感指數（ISI）及胰島素抵抗指數（HOMA-IR） 分光光度法測定大鼠FPG及GHb水平，放免法測定空腹FINS水平，并計算ISI和HOMA-IR。ISI=IN［1/（FPG×FINS）］，HOMAIR=（FRG×FINS）/22.5。

1.2.5.3 RT-PCR測定肝細胞膜胰島素受體（InsR）mRNA表達水平 將大鼠肝臟組織加入Trizol溶液后研磨，分離并保存總RNA，逆轉錄后，進行PCR擴增。InsR擴增條件：94℃3 min；94℃40 s，52℃50 s，72℃90 s，進行30個循環；然后72℃10 min。GAPDH擴增條件：55℃50 s，其余條件與InsR擴增相同。用凝膠緩沖液配制瓊脂糖凝膠，進行DNA樣品電泳，在凝膠成像儀上觀察電泳帶及其位置，通過比較二者的吸光度積分來表示InsR mRNA表達量。

PCR引物序列：正向引物5′-CAAGAAGTTTGTGCACCGGG-3′，反向引物5′-GTCCTTGAGCAGGTTGACGA-3′，預擴增片段為421 bp；GAPDH正向引物5′-CCTTCATTGACCTCAACTAC-3′，反向引物5′-GGAAGGCCATGCCAGTGAGC-3′，擴增片段為594 bp。

1.3 統計學分析 采用SPSS 19.0統計軟件進行正態性檢驗及單因素方差分析，實驗數據以表示，組間比較采用LSD-t檢驗。

2 結果

2.1 對2型糖尿病大鼠血糖 （BG）及糖耐量 （GTT）的影響 由表1可知，模型組0、0.5、2 h的BG及GTT均較空白組顯著升高 （P＜0.01）。給藥6周后，與模型組相比，陽性藥二甲雙胍組0、0.5、2 h三個時間點的BG及GTT均顯著降低 （P＜0.01）；白背三七總黃酮高劑量組各時間點BG及GTT值均顯著降低 （P＜0.01）；白背三七總黃酮中劑量組0、2 h的BG及GTT值顯著降低（P＜0.01），0.5 h的BG值也明顯降低 （P＜0.05）；白背三七總黃酮低劑量組0 h的BG值出現明顯降低（P＜0.05），但0.5、2 h的BG及GTT與模型組相比則無顯著性差異 （P＞0.05）。

2.2 對2型糖尿病大鼠空腹血糖 （FPG）及糖化血紅蛋白（GHb）值的影響 由表2可知，與空白組相比，模型組大鼠FPG及GHb值顯著升高 （P＜0.01）。給藥6周后，二甲雙胍陽性對照組大鼠FPG及GHb水平較模型組均出現顯著下降 （P＜0.01）；高劑量的白背三七總黃酮能使大鼠的FPG、GHb水平較模型組出現顯著下降 （P＜0.01）；白背三七總黃酮中劑量組FPG值顯著降低（P＜0.01），GHb值也明顯降低 （P＜0.05）；白背三七總黃酮低劑量組FPG值明顯降低 （P＜0.05），而GHb值與模型組比較則無顯著性差異 （P＞0.05）。注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

表1 白背三七總黃酮對2型糖尿病大鼠BG及GTT的影響

表1 白背三七總黃酮對2型糖尿病大鼠BG及GTT的影響

組別 BG/（mmol.L-1）0 h 0.5 h 2 h GTT/（mmol.h-1.L-1）空白組 5.04±0.23** 5.95±0.65** 4.78±0.26** 10.79±0.81**18.15±1.86 14.35±1.29 32.40±3.04模型組 16.58±2.99 20.05±3.14 16.68±2.80 36.70±5.78二甲雙胍組 5.94±0.78** 6.92±0.58** 5.80±0.71** 12.76±1.02**白背三七總黃酮高劑量組 7.99±1.82** 10.01±2.96** 8.30±2.36** 18.24±5.09**白背三七總黃酮中劑量組 12.45±1.82** 17.02±2.38* 13.07±1.63** 29.93±3.56**白背三七總黃酮低劑量組 13.97±1.22*

表2 白背三七總黃酮對2型糖尿病大鼠FPG和GHb的影響

表2 白背三七總黃酮對2型糖尿病大鼠FPG和GHb的影響

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 FPG/（mmol.L-1） GHb/（g.m L-1）空白組 4.99±0.38** 14.66±3.31**模型組 16.98±3.00 25.86±3.70二甲雙胍組 5.80±0.69** 15.77±2.55**白背三七總黃酮高劑量組 8.13±1.74** 17.34±2.71**白背三七總黃酮中劑量組 12.17±1.52** 22.33±2.38*白背三七總黃酮低劑量組 14.18±1.29*24.72±2.20

2.3 對2型糖尿病大鼠空腹血清胰島素水平 （FINS）、胰島素敏感指數（ISI）及胰島素抵抗指數（HOMA-IR）的影響 由表3可知，與空白組相比，模型組大鼠的FINS及HOMA-IR水平出現顯著提高（P＜0.01），ISI水平則顯著下降 （P＜0.01）。給藥6周后，陽性藥二甲雙胍、高劑量及中劑量的白背三七總黃酮能使2型糖尿病大鼠的FINS及HOMA-IR水平較模型組顯著下降（P＜0.01），ISI水平則出現顯著上升（P＜0.01）；白背三七低劑量組HOMA-IR與模型組比較出現明顯降低（P＜0.05），而FINS及ISI則無顯著性差異 （P＞0.05）。

表3 白背三七總黃酮對2型糖尿病大鼠FINS，ISI以及HOMA-IR的影響

表3 白背三七總黃酮對2型糖尿病大鼠FINS，ISI以及HOMA-IR的影響

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 FINS/（m IU.L-1）ISI HOMA-IR空白組 38.17±3.14**-5.26±0.11** 8.56±0.94**模型組 62.08±6.18 -6.92±0.18 45.51±7.79二甲雙胍組 44.86±6.80**-5.57±0.18**11.78±1.98**白背三七總黃酮高劑量組41.38±5.44**-5.78±0.22**14.55±3.03**白背三七總黃酮中劑量組51.92±4.49**-6.46±0.21**28.88±5.80**白背三七總黃酮低劑量組59.83±5.12 -6.72±0.12 37.14±4.65*

2.4 對2型糖尿病大鼠肝細胞膜胰島素受體 （InsR）mRNA表達的影響 由表4、圖1可知，與空白組相比，模型組大鼠肝細胞膜的InsR mRNA表達出現顯著下調（P＜0.01）。給藥6周后，陽性藥二甲雙胍及高劑量的白背三七總黃酮均能使大鼠的InsRmRNA表達較模型組出現顯著上調 （P＜0.01），中劑量白背三七總黃酮也能明顯上調InsR mRNA表達 （P＜0.05），低劑量組則無顯著性差異 （P＞0.05）。

表4 白背三七總黃酮對2型糖尿病大鼠肝細胞膜InsR m RNA表達的影響

表4 白背三七總黃酮對2型糖尿病大鼠肝細胞膜InsR m RNA表達的影響

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

表達空白組 2 370.50±178.90組別 InsRmRNA ** 1 142.00±164.05模型組 933.00±80.61二甲雙胍組 2 228.50±68.59**白背三七總黃酮高劑量組 1 678.00±158.39**白背三七總黃酮中劑量組 1 297.00±138.59*白背三七總黃酮低劑量組

圖1 白背三七總黃酮對2型糖尿病大鼠肝細胞膜InsR m RNA表達的影響

3 結論

胰島素是體內唯一能夠降低血糖的激素，機體分泌胰島素后，當其與胰島素受體相結合，通過去磷酸化和磷酸化，激活多種激酶，引起多級聯效應，實現體內血糖的調節，以適應外界環境的不斷變化，維持血糖的穩定［8-9］。如果此過程中的某些環節發生異常，則會影響到胰島素信號轉導，引起糖代謝異常。因此在1942年，Himsworth將糖尿病分為胰島素敏感型和不敏感型兩類，并于1979年在糖尿病分類中確定了胰島素抵抗 （IR）的概念［10］。IR是指機體在促進葡萄糖攝取和利用方面受損，即一定量的胰島素產生的生物學效應低于預期的正常水平［11-13］。研究顯示，胰島素抵抗的發生多與胰島素受體和受體后的缺陷有關。IR不僅是2型糖尿病的主要病機，還是引起心血管疾病、血脂代謝紊亂等多種疾病的重要危險因素［14］。而改善IR是治療上述疾病的關鍵。

糖尿病胰島素抵抗患者，因其胰島素生物效應減低，可造成葡萄糖在脂肪、肌肉及肝臟組織的利用量減少，加劇肝糖原分解為葡萄糖，出現高血糖，因而出現血糖高于

正常或糖耐量異常的現象［15］。但空腹血糖較容易受到進食和糖代謝等因素的影響，因此在2010年，美國ADA糖尿病協會就將糖化血紅蛋白 （GHb）作為診斷糖尿病的標準之一［16］。GHb是葡萄糖與血紅蛋白的β鍵N末端纈氨酸殘基非酶化結合而成，這是一個不可逆的過程，因此GHb的量與血糖濃度成正比。因GHb不易分解，相當穩定，可以可靠的反映出近2、3個月內的平均血糖值，且不易受到飲食、運動等因素的干擾，可以看作是確診糖尿病的一項有重要意義的標記物［16］。

本研究通過高糖高脂飼料喂飼加腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素復制糖尿病胰島素抵抗大鼠模型。鏈脲佐菌素為胰島β細胞毒劑，可引起胰島素缺乏。如單純注射鏈脲佐菌素，誘導的模型較類似于人類Ⅰ型糖尿病。且大劑量注射鏈脲菌素較易損傷肝臟、骨骼肌等靶組織，并對實驗結果產生影響［17-18］。本研究前期以高糖高脂飼料喂飼大鼠4周，引起大鼠高脂血癥、高胰島素血癥等，再小劑量注射鏈脲佐菌素，從而導致糖尿病胰島素抵抗。造模后，可見模型組大鼠FPG、GTT、GHb、FINS、HOMA-IR升高，ISI降低，表明其已經發生了胰島素抵抗。

白背三七地上部分在民間常用于糖尿病、高血脂及高血壓的輔助治療，現代藥理學研究也已經證實了其降血糖及降血脂作用，并確定其主要藥理活性成分為總黃酮類［3-6］。為了進一步觀察白背三七總黃酮對糖尿病胰島素抵抗的影響，并探討其作用機制，本研究復制糖尿病胰島素抵抗大鼠模型，以白背三七總黃酮進行治療。治療后可見，大鼠FPG、GTT、GHb、FINS、HOMA-IR顯著降低，ISI顯著升高，且InsR mRNA的表達顯著增強。結果表明，白背三七總黃酮能夠降低血糖，改善糖耐量，且對IR大鼠的高胰島素血癥也有改善作用。而白背三七總黃酮對糖尿病IR大鼠的改善性作用，與促進肝細胞膜InsR mRNA表達增強，調節受體環節，增強2型糖尿病IR大鼠胰島素的生物效應，抑制胰島素的過度分泌有關。

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R285.5

B

1001-1528（2015）11-2501-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.11.036

2014-11-24

河北省科技支撐計劃項目 （11231005D）

賀 克（1977—），女，碩士，副主任藥師，從事中藥學研究工作。Tel：18633039389，E-mail：hkwkc@sina.com

*通信作者：劉 姣 （1978—），女，碩士，副教授，從事中藥藥理學教學及研究工作。Tel：13483127682，E-mail：fairypc_lj@ 163.com