芎麻滴丸對(duì)血管性認(rèn)知障礙過(guò)程中細(xì)胞凋亡及Caspase-3、Fas蛋白的影響

劉 琳， 蓋祥云， 周 游， 趙 瑛， 王淑靜

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江哈爾濱150076）

芎麻滴丸對(duì)血管性認(rèn)知障礙過(guò)程中細(xì)胞凋亡及Caspase-3、Fas蛋白的影響

劉 琳， 蓋祥云， 周 游， 趙 瑛*， 王淑靜

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江哈爾濱150076）

目的 探討芎麻滴丸對(duì)腦缺血致血管性認(rèn)知障礙（VCI）發(fā)病過(guò)程中神經(jīng)元細(xì)胞凋亡和Caspase-3、Fas凋亡蛋白動(dòng)態(tài)變化的干預(yù)機(jī)制。方法 采用永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈 （2-VO）的方法建立VCI大鼠模型，于模型建立前3 d給予不同劑量的芎麻滴丸及陽(yáng)性對(duì)照藥，分別于術(shù)后7、14、28、42 d采用TUNEL法檢測(cè)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡，用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腦組織Caspase-3、Fas蛋白表達(dá)。結(jié)果 與假手術(shù)組相比，7、14、28、42 d模型組大鼠海馬中均出現(xiàn)凋亡細(xì)胞 （P＜0.01），7、28、42 d模型組Caspase-3陽(yáng)性表達(dá)顯著升高 （P＜0.01），14 d和28 d模型組Fas陽(yáng)性表達(dá)顯著升高 （P＜0.05，P＜0.01）；與模型組相比，7、28、42 d時(shí)芎麻滴丸0.375～1.5 g/kg劑量組和銀杏葉片組，14 d芎麻滴丸0.375 g/kg劑量組和銀杏葉片組凋亡細(xì)胞均顯著減少 （P＜0.01），與模型組相比，除7 d銀杏葉片組和14 d芎麻滴丸1.5 g/kg組外，7、14、28、42 d芎麻滴丸0.375～1.5 g/kg組及銀杏葉片組Caspase-3陽(yáng)性表達(dá)均顯著降低 （P＜0.05，P＜0.01），14、28 d芎麻滴丸0.375～0.75 g/kg量組和銀杏葉片組，28 d芎麻滴丸1.5 g/kg劑量組Fas陽(yáng)性表達(dá)顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)論 腦缺血致VCI過(guò)程中會(huì)通過(guò)Fas信號(hào)途徑伴隨有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且Fas的過(guò)度表達(dá)時(shí)間早于Caspase-3。芎麻滴丸可以抑制VCI發(fā)病過(guò)程中細(xì)胞凋亡的發(fā)生，其機(jī)制與抑制凋亡蛋白Caspase-3、Fas有關(guān)，以芎麻滴丸0.375 g/kg劑量效果最為顯著，在腦缺血初期使用藥物進(jìn)行干預(yù)更有助于延緩或阻止VCI的發(fā)生。

血管性認(rèn)知障礙，永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈，細(xì)胞凋亡，Caspase-3蛋白酶，F(xiàn)as蛋白酶

血管性認(rèn)知功能障礙（vascular cognitive impairment，VCI）是指一組以腦血管病危險(xiǎn)因素，明顯或不明顯的腦血管病引起的從輕度認(rèn)知障礙到癡呆的一大類認(rèn)知損害綜合征［1-2］。采用2-VO法可以導(dǎo)致大鼠慢性前腦血流灌注不足，造成一種慢性腦低灌注狀態(tài)，造模后可以使腦組織產(chǎn)生缺血、缺氧性損害［3-4］。本項(xiàng)目前期研究表明，VCI發(fā)生過(guò)程中大鼠海馬中CytoC、Bcl-2、Bax會(huì)發(fā)生一系列改變，使用芎麻滴丸進(jìn)行早期干預(yù)可以逆轉(zhuǎn)這種情況的發(fā)生［5-6］。那么這些重要的凋亡蛋白是否會(huì)引起最終細(xì)胞凋亡的發(fā)生？Caspase-3、Fas等下游相關(guān)蛋白又是如何改變的？這些都將是本實(shí)驗(yàn)研究的重點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)采用2-VO方法建立VCI模型，分別于模型建立后7、14、28、42 d測(cè)定VCI大鼠神經(jīng)元細(xì)胞凋亡情況，并于模型建立前3 d給予中藥復(fù)方制劑——芎麻滴丸，研究芎麻滴丸對(duì)VCI發(fā)病過(guò)程中大鼠神經(jīng)元細(xì)胞凋亡及凋亡蛋白Caspase-3、Fas的干預(yù)情況。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)VCI發(fā)病過(guò)程中神經(jīng)元細(xì)胞凋亡及Caspase-3、Fas蛋白的變化，探討VCI發(fā)病的關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)，推測(cè)VCI治療的最佳時(shí)間窗，并探討細(xì)胞凋亡可能的產(chǎn)生機(jī)制，同時(shí)結(jié)合前期研究探討VCI引起細(xì)胞凋亡的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律；另一方面通過(guò)研究芎麻滴丸對(duì)VCI發(fā)病不同階段細(xì)胞凋亡及Fas蛋白的影響，尋找有針對(duì)性的VCI預(yù)防用藥。

1 材料

1.1 試驗(yàn)藥物 芎麻滴丸成型前液體：哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)室制備［7］（川芎總酚酸和天麻總苷≥37.77%）。濃縮制成相當(dāng)于1 g/mL生藥的溶液，保存于4℃冰箱備用。銀杏葉片 （產(chǎn)品批號(hào)0907081）購(gòu)自廣西億康藥業(yè)股份有限公司。

1.2 動(dòng)物 成年健康SD雄性大鼠 （12～14周齡）230只，體質(zhì)量為300～350 g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。合格證號(hào)0102009。

1.3 試劑 Caspase-3兔抗大鼠多克隆抗體（產(chǎn)品批號(hào)09D01）、Fas兔抗大鼠多克隆抗體 （產(chǎn)品批號(hào)08G02）均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；水合氯醛 （產(chǎn)品批號(hào)

060707）購(gòu)自上?；瘜W(xué)試劑公司。

1.4 儀器 Leica RM2135石蠟切片機(jī)（德國(guó)萊卡公司）；光學(xué)顯微鏡（日本Olympus BH-2型）。

1.5 方法

1.5.1 VCI模型的復(fù)制 永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈（2-VO）方法：用10%水合氯醛 （3 mL/kg體質(zhì)量）腹腔注射麻醉大鼠，取頸正中切口，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈并結(jié)扎［8］。

1.5.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥 按動(dòng)物體質(zhì)量將動(dòng)物隨機(jī)分為：假手術(shù)組 （生理鹽水10 mL/kg），模型組 （生理鹽水10 mL/kg），芎麻滴丸低劑量組 （相當(dāng)于生藥0.375 g/kg），高劑量組 （相當(dāng)于生藥1.5 g/kg）、中劑量組 （相當(dāng)于生藥0.75 g/kg）和銀杏葉片組（61.359 mg/kg）。每組動(dòng)物分別于造模后第7、14、28、42天取材。模型復(fù)制前3 d開始灌胃給藥，2次/d。

1.5.3 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 分別于造模后7、14、28、42 d，大鼠末次給藥45 min后斷頭處死，分開大鼠顱骨，迅速在冰盤上取出大腦，正中對(duì)稱切開，將左側(cè)大腦組織用4%多聚甲醛溶液固定，并進(jìn)行脫水、透明、浸蠟、包埋，制作石蠟切片。脫蠟后采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）介導(dǎo)的原位末端標(biāo)記法 （TUNEL）測(cè)定凋亡率，按檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，陰性對(duì)照組用PBS代替一抗。最后脫水、透明、封片。光鏡下觀察，細(xì)胞核呈棕黃色為凋亡細(xì)胞，同一部位HE染色組織切片在同一放大倍數(shù)下隨機(jī)選取10個(gè)視野計(jì)算TUNEL染色陽(yáng)性凋亡神經(jīng)元細(xì)胞個(gè)數(shù)。

1.5.4 免疫組化法分別檢測(cè)大鼠海馬中Caspase-3及Fas表達(dá) 各組于模型復(fù)制后各時(shí)間點(diǎn)給藥后處死，取左側(cè)大腦制作石蠟切片。石蠟切片常規(guī)免疫組化處理，兔抗鼠Caspase-3（1：150）；兔抗大鼠Fas（1：100）一抗；中性樹脂封片保存。BI-2000免疫組化圖像分析系統(tǒng)分析每張切片10個(gè)視野下光密度值，并求取其平均值。

1.5.5 統(tǒng)計(jì)方法 數(shù)據(jù)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析和多組間比較，以P＜0.05為差異具有顯著性意義，P＜0.01為差異具有非常顯著性意義。

2 結(jié)果

2.1 TUNEL檢測(cè)凋亡率的結(jié)果 光鏡下觀察，TUNEL染色陽(yáng)性凋亡神經(jīng)元的細(xì)胞核呈棕黃色，陰性對(duì)照組無(wú)黃色或棕黃色染色。假手術(shù)組大鼠海馬組織中只有零星的凋亡神經(jīng)元。模型組大鼠海馬各區(qū)中均出現(xiàn)大量細(xì)胞核呈現(xiàn)棕黃色的神經(jīng)元細(xì)胞，細(xì)胞排列不規(guī)則，細(xì)胞體積縮小，提示為凋亡細(xì)胞。7、14、28、42 d芎麻滴丸低、中劑量組中海馬區(qū)內(nèi)凋亡細(xì)胞數(shù)量較模型組明顯減少，陰性神經(jīng)元細(xì)胞較多。

與假手術(shù)組相比，7、14、28、42 d模型組海馬中均出現(xiàn)大量凋亡神經(jīng)元細(xì)胞 （P＜0.01）；與模型組相比，14 d時(shí)芎麻滴丸低劑量組和銀杏葉片組凋亡細(xì)胞均顯著減少（P＜0.01），14 d時(shí)芎麻滴丸中、高劑量組凋亡細(xì)胞也有一定程度減少，但無(wú)顯著性差異 （P＞0.05），7、28、42 d時(shí)芎麻滴丸低、中、高劑量組和銀杏葉片組凋亡細(xì)胞均顯著減少 （P＜0.01）。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠腦組織海馬TUNEL陽(yáng)性表達(dá)結(jié)果

表1 各組大鼠腦組織海馬TUNEL陽(yáng)性表達(dá)結(jié)果

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與假手術(shù)組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

7 d 14 d 28 d 42 d假手術(shù)組 —組別 劑量/（g.kg-1）9.50±1.87 8.00±1.41 8.00±2.37 9.00±1.41模型組 — 30.33±1.63△△ 12.83±3.19△△ 31.83±3.06△△ 31.17±2.32△△芎麻滴丸組 0.375 16.17±2.32** 9.00±2.61** 15.50±1.87** 14.33±2.16**芎麻滴丸組 0.75 18.57±1.99** 10.33±2.51 20.67±2.16** 19.33±1.75**芎麻滴丸組 1.5 22.83±2.64** 11.17±1.94 23.67±3.33** 23.67±4.76**銀杏葉組 0.061 15.83±1.94** 8.00±1.41** 16.50±1.52** 16.33±2.16**

2.2 各組大鼠腦組織海馬區(qū)Caspase-3陽(yáng)性表達(dá) 陰性對(duì)照組未出現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)。假手術(shù)組大鼠海馬區(qū)可見少量胞漿中出現(xiàn)淺黃色顆粒的神經(jīng)細(xì)胞，7、28、42 d模型組大鼠海馬中均可見大量胞漿或胞核出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒的神經(jīng)元細(xì)胞。芎麻滴丸低、中、高劑量組和銀杏葉片組均可不同程度的降低大鼠腦組織海馬神經(jīng)元細(xì)胞Caspase-3陽(yáng)性表達(dá)。

與假手術(shù)組相比，7、28、42 d模型組Caspase-3陽(yáng)性表達(dá)顯著升高 （P＜0.01）；與模型組相比，除7 d銀杏葉片組和14 d芎麻滴丸高劑量組外，7、14、28、42 d芎麻滴丸低、中、高劑量組及銀杏葉片組Caspase-3陽(yáng)性表達(dá)均顯著降低 （P＜0.05，P＜0.01），其中以28 d芎麻滴丸中劑量組降低最顯著，但結(jié)果并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）。結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠腦組織海馬Caspase-3陽(yáng)性表達(dá)結(jié)果

表2 各組大鼠腦組織海馬Caspase-3陽(yáng)性表達(dá)結(jié)果

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與假手術(shù)組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

7 d 14 d 28 d 42 d假手術(shù)組 —組別 劑量/（g.kg-1）0.217±0.034 0.240±0.043 0.181±0.031 0.166±0.054模型組 — 0.314±0.041△△ 0.250±0.018 0.306±0.054△△ 0.312±0.066△△芎麻滴丸組 0.375 0.189±0.036** 0.207±0.033* 0.219±0.037** 0.202±0.012**芎麻滴丸組 0.75 0.260±0.033** 0.205±0.060* 0.183±0.060** 0.226±0.029**芎麻滴丸組 1.5 0.276±0.042* 0.248±0.017 0.260±0.071** 0.248±0.041**銀杏葉組 0.061 0.331±0.079 0.168±0.036** 0.222±0.026** 0.197±0.079**

2.3 各組大鼠腦組織海馬區(qū)Fas陽(yáng)性表達(dá) 陰性對(duì)照組未出現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)。Fas以胞漿表達(dá)為主，呈現(xiàn)黃色或棕色顆粒狀。與假手術(shù)組相比，7、14、28、42 d模型組海馬區(qū)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增多著色增強(qiáng)，其中以28 d模型組最為顯著；而各治療組與模型組相比，陽(yáng)性表達(dá)均有不同程度的降低。

與假手術(shù)組相比，14 d模型組海馬區(qū)Fas陽(yáng)性表達(dá)升高 （P＜0.05），28 d模型組海馬區(qū)Fas陽(yáng)性表達(dá)顯著升高（P＜0.01），7 d和42 d模型組Fas陽(yáng)性表達(dá)也有一定升高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與模型組相比，14 d銀杏葉片組Fas陽(yáng)性表達(dá)降低 （P＜0.05），14 d芎麻滴丸低、中劑量組Fas陽(yáng)性表達(dá)顯著降低 （P＜0.01），28 d芎麻滴丸低、中、高劑量組和銀杏葉片組Fas陽(yáng)性表達(dá)顯著降低 （P＜0.01）。結(jié)果見表3。

表3 各組大鼠腦組織海馬Fas陽(yáng)性表達(dá)結(jié)果

表3 各組大鼠腦組織海馬Fas陽(yáng)性表達(dá)結(jié)果

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與假手術(shù)組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

7 d 14 d 28 d 42 d假手術(shù)組 —組別 劑量/（g.kg-1）0.298±0.024 0.291±0.012 0.339±0.044 0.289±0.064模型組 — 0.326±0.023 0.383±0.042△ 0.470±0.063△△ 0.341±0.030芎麻滴丸組 0.375 0.281±0.031 0.305±0.036** 0.329±0.042** 0.306±0.049芎麻滴丸組 0.75 0.292±0.026 0.290±0.015** 0.320±0.037** 0.295±0.025芎麻滴丸組 1.5 0.373±0.029 0.327±0.035 0.350±0.034** 0.343±0.037銀杏葉組 0.061 0.337±0.025 0.308±0.028* 0.336±0.042**0.303±0.096

3 討論

腦缺血性腦血管病是血管性認(rèn)知法障礙發(fā)生的主要原因。2-VO法是以慢性低灌注引起腦缺血缺氧，最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞功能下降，并引起學(xué)習(xí)記憶障礙的VCI模型建立方法［8］。本試驗(yàn)從結(jié)果上也印證了這一說(shuō)法。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，模型復(fù)制第7天，大鼠即出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡，但7 d后，大鼠神經(jīng)元細(xì)胞凋亡情況又有所恢復(fù)。有文獻(xiàn)報(bào)道2-VO 24 h后大鼠腦血流量迅速下降，1～2周內(nèi)大鼠腦血流量逐漸恢復(fù)，并與2周時(shí)腦血流量恢復(fù)達(dá)高峰，這與本研究的時(shí)間點(diǎn)一致［9］。推測(cè)這段時(shí)期很可能是急性缺血期和慢性缺血期之間的分水嶺。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，腦缺血28 d和42 d時(shí)，大鼠神經(jīng)元繼續(xù)凋亡，且凋亡程度有所增加，這可能是導(dǎo)致大鼠最終出現(xiàn)VCI的原因之一。

細(xì)胞凋亡是缺血性認(rèn)知障礙的主要病理生理機(jī)制之一，本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)腦缺血后14 d及28 d，F(xiàn)as過(guò)度表達(dá)，其中以28 d表達(dá)更為明顯。而Caspase-3則在28 d及42 d時(shí)過(guò)度表達(dá)，F(xiàn)as的高表達(dá)時(shí)間早于Caspase-3高表達(dá)時(shí)間，Caspase-3的高表達(dá)與細(xì)胞凋亡正相關(guān)。此結(jié)果提示，作為一種重要的死亡受體，F(xiàn)as可以通過(guò)Fas信號(hào)途徑最終激活凋亡效應(yīng)分子Caspase-3而促發(fā)凋亡。這一現(xiàn)象也與文獻(xiàn)報(bào)道相吻合［10-11］。

結(jié)合前期實(shí)驗(yàn)［3］發(fā)現(xiàn)，作為細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，細(xì)胞凋亡的線粒體途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑和死亡受體途徑對(duì)會(huì)對(duì)Caspase-3的變化產(chǎn)生影響。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)腦缺血后28 d及42 d，Caspase-3過(guò)度表達(dá)，這與細(xì)胞凋亡的第二個(gè)高峰相吻合。而Caspase-3變化后將導(dǎo)致細(xì)胞釋放CAD，從而降解DNA，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，腦缺血28 d和42 d時(shí)，大鼠神經(jīng)元繼續(xù)凋亡，且凋亡程度有所增加，這可能是導(dǎo)致大鼠最終出現(xiàn)VCI的原因之一。

芎麻滴丸是傳統(tǒng)中藥復(fù)方芎麻湯經(jīng)現(xiàn)代工藝提取分離并純化的中藥復(fù)方現(xiàn)代制劑，前期試驗(yàn)表明芎麻滴丸可以改善2-VO所致的大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，芎麻滴丸高、中、低劑量均可以改善大鼠腦缺血后7、28、 42 d所產(chǎn)生的細(xì)胞凋亡，其中以芎麻滴丸低劑量組作用最強(qiáng)，這與前期研究結(jié)果一致［12］。芎麻滴丸低劑量在缺血早期下調(diào)Fas作用最強(qiáng)，隨著缺血時(shí)間延長(zhǎng)，在缺血的中后期進(jìn)一步抑制由Caspase-3誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的發(fā)生，并于腦缺血后42 d抑制細(xì)胞凋亡達(dá)高峰。芎麻滴丸中、高劑量在腦缺血的中后期可以抑制Fas高表達(dá)，進(jìn)而通過(guò)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)抑制細(xì)胞凋亡。而芎麻滴丸低劑量改善大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙最為顯著，因此推測(cè)芎麻滴丸預(yù)防大鼠VCI的過(guò)程與其抑制大鼠神經(jīng)元細(xì)胞凋亡有關(guān)，其作用機(jī)制可能是抑制Fas蛋白的過(guò)度表達(dá)，且在腦缺血初期使用藥物進(jìn)行干預(yù)更有助于延緩或阻止VCI的發(fā)生。

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R285.5

B

1001-1528（2015）11-2505-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.11.037

2014-07-05

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 （81373548）；黑龍江省自然科學(xué)基金 （H201382）

劉 琳（1978—），女，博士，副教授，研究方向?yàn)樯窠?jīng)藥理學(xué)。Tel：15004658705，E-mail：liulinyx@163.com

*通信作者：趙 瑛 （1960—），女，博士，教授，研究方向?yàn)橹兴幏乐沃卮蠹膊　el：13936678930，E-mail：zhaoy0204@163.com

日期：2014-12-01

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