山核桃青皮萃取物抗內源性H2O2致血管內皮細胞凋亡及機制研究

趙行宇， 秦迎新， 沈 楠， 趙麗靜， 朱文赫， 陳默然， 張 巍

（吉林醫藥學院，吉林吉林132013）

山核桃青皮萃取物抗內源性H2O2致血管內皮細胞凋亡及機制研究

趙行宇， 秦迎新， 沈 楠， 趙麗靜， 朱文赫， 陳默然， 張 巍

（吉林醫藥學院，吉林吉林132013）

目的 探討山核桃青皮萃取物對過氧化氫 （H2O2）誘導血管內皮細胞凋亡的影響及可能機制。方法 以葡萄糖氧化酶 （GOX）催化生成內源性H2O2制作內皮細胞損傷模型；加入不同劑量的山核桃青皮萃取物，觀察細胞形態學改變；Annexin/PI雙標記染色，流式細胞儀檢測細胞凋亡率；Western blot檢測Caspase-3及Bcl-2和Bax蛋白表達量。結果 山核桃青皮萃取物改善了內源性H2O2導致的內皮細胞形態變化；流式檢測結果顯示萃取物對細胞模型凋亡有明顯的抑制作用；電泳結果顯示Caspase-3和Bax表達量降低，Bcl-2表達增加，隨劑量增加，作用增加，具有劑量依賴性。結論 山核桃青皮萃取物對內源性H2O2誘導的血管內皮細胞凋亡有抑制作用，其機制可能通過啟動Caspase途徑實現。

山核桃；細胞凋亡；過氧化氫

血管內皮損傷是動脈粥樣硬化等多種疾病發生的重要因素，在針對血管內皮損傷及保護作用進行的研究中，關于中藥提取成分的作用及機制的研究，近年有所增加［1-6］。內皮細胞損傷的原因中，氧化應激受到一些研究者的關注，因為氧化應激不僅可以直接導致細胞損傷，出現凋亡，而且多種凋亡刺激都伴隨有氧化應激或者增加了細胞內活性氧集團ROS水平［7-8］。研究也表明，通過抑制氧化應激可以抑制細胞凋亡，許多凋亡抑制劑都是通過增強細胞抗氧化的能力發揮作用，或者其本身就具有抗氧化活性。山核桃青皮是山核桃未成熟果實的青果皮，具有清熱解毒、抑菌鎮咳及抗癌等作用［7-10］。相關研究表明：山核桃青果皮萃取物在體外具有抗氧化活性［11-13］，但針對內皮氧化應激損傷后，萃取物對其的作用及相關機制未見報道。本研究以GOX催化葡萄糖產生內源性H2O2制作內皮細胞損傷模型，觀察山核桃青皮萃取物干預后，氧化應激損傷的血管內皮細胞凋亡變化，并對這一作用的可能機制進行探討，為后續的研究提供進一步的證據。

1 材料方法

1.1 藥物萃取 山核桃采自吉林省林區，室溫下晾干。將核桃果實處理后得核桃青皮，用80%乙醇回流萃取30 min，于低溫回收溶劑，萃取物用水分散后用乙酸乙酯萃取，回收溶劑得萃取物0.324 kg，采用普魯士藍法測定總酚的量，極性部位總酚的量為18.2%。收集于旋轉蒸發瓶中蒸干，過濾除菌，萃取物稱重以DMSO溶解終質量濃度為500μg/mL［14］。

1.2 試劑 胎牛血清由杭州四季青公司生產；高糖DMEM培養基購自美國GIBCO公司；胰蛋白酶（Trypsin）、過氧化氫檢測試劑盒購于艾美捷科技有限公司，Annexin-V/PI雙染凋亡試劑盒、葡萄糖氧化酶（GOX）、Caspase-3、Bcl-2和Bax抗體購自美國Sigma公司。

1.3 萃取物對葡萄糖氧化酶活性的影響 取24孔版，每培養孔加入高糖DMEM培養基，分5組，復孔數為5，置培養箱靜置1 h，各組分別加入50μL培養基、10 mU GOX、10mU GOX+25μg/mL萃取物、10 mU GOX+50 μg/m L萃取物、10 mU GOX+100μg/mL萃取物，在1、3、6、12 h按試劑盒的檢測方法測量過氧化氫產生量。

1.4 細胞株及培養 人血管內皮細胞系 （EVC-304），購于中科院上海細胞庫，由吉林醫藥學院科學實驗室保存。細胞培養于高糖DMEM培養液中，培養條件為在5%CO2、濕度95%。每2天更換1次培養液，每周按1：3傳代。

1.5 內皮細胞形態學觀察 取對數生長期的細胞，培養24 h，分成5組，正常對照組、10 mU GOX組、10 mU GOX+25μg/mL萃取物組、10 mU GOX+50μg/mL萃取物組、10 mU GOX+100μg/mL萃取物組，用DMEM培養基稀釋液分別培養24 h后，倒置顯微鏡下觀察內皮細胞的形態學改變。

1.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡 細胞處理同 “1.4”項，12 h后用胰酶消化，PBS洗滌細胞2次，在15 000 r/m in條件下離心10min，棄去上清液；按試劑盒說明書分別加入AnnexinⅤ-FITC和PI，用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.7 Western blot檢測Caspase-3及Bcl-2和Bax蛋白表達把上述分組培養的細胞用裂解液裂解后，收集提取細胞蛋

白，使用BCA法測蛋白的量。上樣量取60μg蛋白，設備為SDS-PAGE電泳儀，電轉凝膠上的蛋白至PVDF膜，兔抗人Caspase-3、Bcl-2及Bax抗體稀釋至1：1 000，4℃冰箱中孵育過夜，再用辣根過氧化物酶標記的二抗孵育2 h后，曝光顯影。以β-actin為內參，數據以正常對照組基準，計算各個樣品相對于正常對照組蛋白量的相對表達量。

1.8 統計學方法 統計分析軟件為SPSS 13.0版本，不同劑量組數據先進行方差齊性檢驗，再進行單因素方差分析和Student-Newman-Keuls（SNK）檢驗。

2 結果

2.1 萃取物對葡萄糖氧化酶活性的影響 葡萄糖氧化酶在不同質量濃度萃取物條件下，產生過氧化氫的量見表1。可見與正常對照組相比，不同質量濃度萃取物和GOX組反應產生過氧化氫濃度明顯增加，差異顯著 （P＜0.01），同一時間點過氧化氫的量隨萃取物質量濃度增加所有下降，但組間沒有顯著性差異，不同時間點過氧化氫的量沒有顯著性差異。

表1 不同萃取物質量濃度對葡萄糖氧化酶催化產生H2O2的量的影響

表1 不同萃取物質量濃度對葡萄糖氧化酶催化產生H2O2的量的影響

注：與正常對照組比較，**P＜0.01

21.5±4.3 20.9±5.1 20.3±5.3 19.4±6.2 10 mU GOX 53.3±5.2** 48.3±6.8** 50.3±4.9** 52.3±5.9**10 mU GOX+25μg/m L山核桃青皮萃取物 52.4±6.1** 49.3±4.9** 49.6±5.7** 49.5±6.3**10 mU GOX+50μg/m L山核桃青皮萃取物 50.5±5.7** 48.3±5.0** 48.7±5.8** 48.9±6.8**10 mUGOX+100μg/mL山核桃青皮萃取物 48.8±5.9** 47.1±5.6** 48.5±6.0** 50.1±6.6 1 h 3 h 6 h 12 h正常對照組組別H2O2/（μmol.L-1）**

2.2 萃取物對EVC-304細胞形態的影響 正常對照組（圖1A）細胞生長良好，貼壁生長，呈多角形或長梭形，呈鵝卵石樣鋪滿底層。而10 mU GOX組（圖1B）細胞在作用24 h后，細胞胞體變小、間隙增大，細胞變圓收縮，胞漿透明，失去細胞間連接，大多數細胞懸浮脫落；不同質量濃度萃取物與10mU GOX混合培養后（圖1C～圖1E）細胞形態與狀態與正常對照相似，但隨劑量增加，細胞形態改善越好，具有劑量依賴性。

圖1 各組EVC-304細胞形態（×400）

2.3 萃取物對細胞凋亡的影響 各組內皮細胞的凋亡百分比見表2，由表可見，正常對照組的凋亡最少，10 mU GOX組凋亡最多，與正常對照組比較，其它各組差異顯著 （P＜0.01）；與10 mU GOX組比，其它各組差異顯著 （P＜0.05，P＜0.01）；不同給藥劑量組凋亡量介于正常對照組與10 mU GOX組之間，隨劑量增加，凋亡增加。具有劑量依賴性。

表2 各組對EVC-304細胞凋亡的影響

表2 各組對EVC-304細胞凋亡的影響

注：與正常對照組比較，**P＜0.01；與10 mU GOX組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別 細胞凋亡率/%正常對照組 3.15±1.07##10 mUGOX組 46.31±4.85**10 mUGOX+25μg/mL山核桃青皮萃取物組 9.48±3.17**##10 mUGOX+50μg/mL山核桃青皮萃取物組 18.59±5.24**##10 mU GOX+100μg/m L山核桃青皮萃取物組 32.65±6.13**#

2.4 萃取物對Caspase-3及Bcl-2和Bax蛋白表達 各組內皮細胞的Caspase-3及Bcl-2和Bax蛋白相對表達情況見圖2和表3。結果可知，正常對照組與GOX組表達量存在明顯差異 （P＜0.01），與正常對照組相比，不同劑量萃取物導致Caspase-3蛋白表達升高，25μg/mL組差異顯著（P＜0.05）；Bcl-2蛋白表達降低，25μg/mL和50μg/mL山核桃青皮萃取物組差異顯著 （P＜0.01，P＜0.05）；Bax蛋白表達升高，25μg/mL和50μg/mL山核桃青皮萃取物組差異顯著（P＜0.01，P＜0.05）。與GOX組相比，使用萃取物后，Caspase-3蛋白表達下降，不同劑量給藥組差異顯著（P＜0.05，P＜0.01）；Bcl-2蛋白表達上升，50μg/mL和100μg/mL山核桃青皮萃取物組差異顯著 （P＜0.05，P＜0.01）；Bax蛋白表達下降，100μg/mL山核桃青皮萃取物組差異顯著 （P＜0.01）。隨萃取物劑量增加，變化越明顯，具有劑量依賴特性。

圖2 萃取物對Caspase-3、BcI-2和Bax蛋白表達的影響

表3 各組Caspase-3及BcI-2和Bax蛋白相對表達量

表3 各組Caspase-3及BcI-2和Bax蛋白相對表達量

注：與10 mU GOX組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與正常對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

Caspase-3 Bcl-2 Bax正常對照組10 mU GOX組組別1** 2.31±0.98##1** 0.31±0.16##1** 3.35±1.05##10 mUGOX+25μg/mL山核桃青皮萃取物組 2.01±0.87*# 0.43±0.17## 2.83±0.93##10 mU GOX+50μg/m L山核桃青皮萃取物組 1.65±0.74** 0.55±0.17*# 2.11±0.89#10 mU GOX+100μg/m L山核桃青皮萃取物組 1.29±0.34** 0.65±0.16** 1.75±0.90**

3 討論

在體內正常水平的H2O2在具有一定意義，如參與免疫和信號傳導的過程［15-18］。但在一些異常狀態時，H2O2產生過多，就會產生破壞作用，損傷人體正常的組織細胞，損傷核酸結構，誘發突變及細胞凋亡等改變，進而引發老年癡呆癥、心臟病、帕金森病和腫瘤等多種疾病［19-22］。在我們的研究中，針對人血管內皮細胞首次采用了酶催化，緩慢而持久的產生內源性H2O2誘導損傷，避免了外源性H2O2損傷嚴重且迅速消失、無法模擬體內H2O2損傷的缺點。從不同質量濃度的萃取物與GOX在高糖培養液中生成過氧化氫的實驗結果看，過氧化氫的量比較穩定，至于高劑量萃取物質量濃度下過氧化氫的量的下降趨勢，可能是由于酚類物質自身的抗氧化作用導致的過氧化氫分解造成的，但由于對過氧化氫的量的影響尚未達到顯著的差異，該損傷模型可以用于實驗研究。實驗結果也顯示：加入GOX后，細胞形態上改變明顯，流式結果也顯示細胞出現大量的凋亡，說明，加入GOX后，可以有效的模擬內源性H2O2損傷造成的凋亡。使用不同質量濃度的萃取物進行干預的結果表明，核桃青皮萃取物對內源性H2O2損傷導致的凋亡作用具有抑制作用，說明萃取物對由內源性H2O2損傷的血管內皮細胞具有保護作用，并且在一定劑量范圍內，質量濃度越高抑制作用也越強，說明這種保護作用有一定的劑量依賴特點。同時我們也觀察到萃取物干預后，Caspase-3及Bax蛋白表達下降、Bcl-2蛋白表達增加，這說明，萃取物的保護作用與對凋亡相關蛋白Bcl-2和Bax表達的調節以及Caspase凋亡通路有關，而且這種變化也具有劑量依賴的特點，說明萃取物可以影響凋亡相關蛋白的表達，實現對凋亡通路的調控。Bax蛋白在對Caspase凋亡通路的影響上，表現為促進凋亡的發生，其表達的增加會增加Bax蛋白的同源結合，激活Caspase凋亡通路，引發凋亡。而Bcl-2蛋白與Bax競爭異源結合，抑制Bax蛋白對Caspase凋亡通路的激活，發揮對H2O2損傷細胞的保護作用。實驗中Caspase-3蛋白表達下降的結果也說明，除了上述的抑制凋亡作用外，其還可以通過下調Caspase凋亡通路的蛋白，來實現對細胞的保護作用。但這兩種作用之間有無相互影響，以及是否還有其他的原因，仍然需要進一步的研究。

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R285.5

B

1001-1528（2015）11-2511-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.11.039

2014-10-15

吉林省科技廳科技發展項目 （20130101157JC）；吉林省教育廳 “十二五”科學技術研究項目 （2012-334）；吉林省教育廳“十二五”科學技術研究項目 （2014-363）

趙行宇（1970—），男，碩士，副教授，研究方向為抗氧化應激中藥篩選。Tel：13844239332，E-mail：jlmmczw@163.com