壯藥依肝達對小鼠急性肝損傷的保護作用

李以軍， 張文濤， 鄭作文*

（1.廣西壯族自治區民族醫院廣西醫科大學附屬民族醫院，廣西 南寧530001；2.廣西中醫藥大學，廣西南寧530001）

壯藥依肝達對小鼠急性肝損傷的保護作用

李以軍1， 張文濤2， 鄭作文2*

（1.廣西壯族自治區民族醫院廣西醫科大學附屬民族醫院，廣西 南寧530001；2.廣西中醫藥大學，廣西南寧530001）

目的 研究壯藥依肝達對四氯化碳（CCl4）和D-氨基半乳糖（D-GalN）所致小鼠急性肝損傷的保護作用。方法 分別采用CCl4、D-GalN誘導的急性肝損傷小鼠為模型，檢測用藥后小鼠血清中丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶 （AST）的量，并對肝組織進行病理檢查及損傷評分。結果 CCl4肝損傷實驗中，依肝達高、中劑量可降低急性肝損傷小鼠血清ALT的量 （P＜0.05），對AST無明顯作用，同時依肝達能減輕肝損傷小鼠肝組織胞漿凝聚及細胞壞死程度；D-GalN肝損傷實驗中，依肝達高、中、低劑量均能降低血清ALT水平 （P＜0.05），僅高劑量能降低急性肝損傷小鼠血清AST水平 （P＜0.05），同時依肝達能減輕小鼠肝組織胞漿凝聚程度。結論 壯藥依肝達對CCl4和D-GalN引起的急性肝損傷有保護作用。

依肝達；急性肝損傷；CCl4；D-GalN

壯藥依肝達主要由廣西壯族民間特色中草藥飯湯子（Viburnum Setigerum Hance）、田基黃（Hypericum japonicum Thumb）、三姐妹Rabdosia temifolia（D.Don）Hara等組成，具有清熱解毒，利膽退黃等功效，臨床用于治療急慢性肝炎，療效顯著。現代藥理學研究發現，飯湯子、田基黃、三姐妹均有顯著的保肝作用［1-3］，及抗乙肝病毒的作用［4-5］，故本實驗以壯藥依肝達為研究對象，進一步觀察其對急性肝損傷的保護作用。

1 材料

1.1 藥物提取與制備 依肝達：取三姐妹200 g、飯湯子300 g、田基黃150 g，混勻后用95%乙醇浸泡2 h后，水浴中回流提取2次，先后用10倍量與8倍量乙醇提取2 h，1 h后冷卻過濾，合并濾液濃縮，得黑棕色浸膏，每克浸膏相當于13.6 g生藥。

1.2 試劑 聯苯雙酯 ［廣州星群 （藥業）股份有限公司，批號GF40085］；D-GalN（啟東市久豐工貿有限公司，批號20040610）；CCl4［中國醫藥 （集團）上海化學試劑公司，批號2010202］；丙氨酸氨基轉移酶ALT、天門冬氨酸氨基轉移酶AST試劑盒 （南京建成生物工程研究所，批號20100210）。

1.3 儀器 離心機 （珠海黑馬醫學儀器有限公司）；Lambda 35 UV（美國鉑金艾爾默公司）；電子天平 （德國賽多利斯公司，型號BP211D）；Motic生物顯微鏡（麥克奧迪實業集團有限公司，型號DMB-1223）。

1.4 動物 SPF級昆明種小鼠，18～22 g，雌雄兼用，購于廣西醫科大學實驗動物中心 （生產許可證號：SCXK桂2009-0002）。

2 方法

2.1 壯藥依肝達對CCl4所致急性肝損傷小鼠的影響 將SPF級昆明種小鼠按體質量隨機分為空白組、模型組、陽性組 （聯苯雙酯，600 mg/kg）、壯藥依肝達高、中、低劑量組 （17、8.5、4.25 g生藥/kg）。灌胃給藥，空白組和模型組給予純凈水，其余各組給予相應的藥物，給藥容量均為20 mL/kg，1次/d，連續10 d。末次給藥后禁食不禁水，8 h后除空白組外其余各組腹腔注射0.1%CCl4花生油溶液，容量為10 m L/kg，12 h后采血，測定血清中ALT、AST的量，取肝大葉用10%甲醛固定，石蠟包埋，HE染色，光鏡下觀察肝組織的病理改變，對肝組織行病理切片和病變評分［6-7］，評分指標與方法見表1。

表1 肝組織病變程度評分方法

2.2 壯藥依肝達對D-GalN所致急性肝損傷小鼠的影響同 “2.1”項方法進行動物分組、給藥。末次給藥后禁食不禁水，8 h后除空白組外其余均腹腔注射D-GalN溶液，容量為10mL/kg，16 h采血，測定血清中ALT、AST水平，取肝大葉同 “2.1”項方法。

2.3 統計學處理 采用SPSS 13.0軟件，數據均以表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為有統計學意義。

3 結果

3.1 壯藥依肝達對CCl4所致急性肝損傷小鼠的影響 由表2可知，依肝達高、中劑量組可明顯降低小鼠血清中ALT的水平，與模型組比較有顯著性差異 （P＜0.05）；依肝達對小鼠血清AST的升高無明顯影響 （P＞0.05）。由表3可知，正常組小鼠肝組織細胞結構清晰、完整，未見炎性細胞浸潤；模型組肝細胞胞可見炎性細胞浸潤，胞漿凝聚、細胞壞死程度明顯；依肝達高、中劑量組能改善肝組織胞漿凝聚、細胞壞死的程度，與模型組比較有顯著性差異 （P＜0.01或P＜0.05）；低劑量組能改善肝細胞壞死程度，與模型組比較有顯著差異 （P＜0.05）。

表2 壯藥依肝達對CCI4所致急性肝損傷小鼠血清ALT、AST的影響

表2 壯藥依肝達對CCI4所致急性肝損傷小鼠血清ALT、AST的影響

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 動物數/只 劑量/（g.kg-1） ALT/（U.L-1） ）空白組 12 — 64.4±20.64** 104.2±25.31**12 4.25 495.4±109.97 264.4±66.49模型組 12 — 471.5±54.93 181.2±38.50陽性組 12 0.6 71.2±32.65** 148.0±29.31*依肝達高劑量組 12 17 385.2±100.57* 182.0±47.23依肝達中劑量組 11 8.5 378.8±129.78* 204.0±49.97依肝達低劑量組

表3 壯藥依肝達對CCI4所致肝損傷小鼠肝組織病變的影響評分

表3 壯藥依肝達對CCI4所致肝損傷小鼠肝組織病變的影響評分

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 水腫 氣變 脂變 胞凝 壞死空白組 1.05±1.36 0.32±0.78 1.27±1.33 0.05±0.15** 0.21±0.33**模型組 1.96±1.30 0.33±0.96 1.75±1.75 1.92±0.76 2.33±0.91陽性組 2.17±1.03 0.21±0.26 2.00±0.77 0.13±0.23** 0.58±0.51**依肝達高劑量組 0.96±0.75 0.17±0.33 2.29±0.72 0.42±0.36** 0.58±0.47**依肝達中劑量組 1.32±1.28 0.31±0.46 2.31±0.98 0.41±0.38** 1.05±0.52*依肝達低劑量組 0.67±0.54 0.08±0.19 1.42±1.61 0.50±0.56 1.13±0.71*

3.2 壯藥依肝達對D-GalN所致急性肝損傷小鼠的影響

由表4可知，依肝達高、中、低劑量組均可明顯降低肝損傷小鼠血清ALT的量，與模型組比較有顯著性差異 （P＜0.05）；依肝達高劑量組可明顯降低肝損傷小鼠血清AST的量，與模型組比較有顯著性差異 （P＜0.05）。由表5可知，正常組小鼠肝細胞結構清晰、完整，未見明顯病理改變；模型組肝細胞可見炎性細胞浸潤，胞漿凝聚、細胞壞死較明顯；依肝達高、中、低劑量均能改善肝組織胞漿凝聚，與模型組比較有顯著性差異 （P＜0.05）；依肝達高、中、低劑量對肝組織胞漿凝聚的改善作用，似以低劑量較優，但高、中劑量與低劑量比較并無顯著性差異 （P＞0.05）。

表4 壯藥依肝達對D-GaIN所致急性肝損傷小鼠血清ALT、AST的影響

表4 壯藥依肝達對D-GaIN所致急性肝損傷小鼠血清ALT、AST的影響

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 動物數/只 劑量/（g.kg-1） ALT/（U.L-1） AST/（U.L-1）空白組 12 — 39.6±9.87** 51.1±11.16**114.6±47.28模型組 11 — 208.2±89.16 126.7±40.24陽性組 11 0.6 63.8±50.29** 90.5±31.21*依肝達高劑量組 11 17 134.0±73.13* 90.6±31.41*依肝達中劑量組 10 8.5 143.4±45.53* 119.9±40.63依肝達低劑量組 10 4.25 125.0±56.15*

表5 壯藥依肝達對D-Ga IN所致肝損傷小鼠肝組織病變的影響評分

表5 壯藥依肝達對D-Ga IN所致肝損傷小鼠肝組織病變的影響評分

注：與模型組比較，*P＜0.05

組別 水腫 氣變 脂變 胞凝 壞死空白組 1.03±1.04 0±0 0.96±0.69 0.04±0.14* 0.71±0.39*模型組 1.30±1.10 0±0 0.71±0.99 0.92±1.10 1.38±0.86陽性組 0.88±1.04 0±0 0.46±0.58 0.08±0.19* 0.58±0.55*依肝達高劑量組 1.55±1.21 0±0 0.31±0.75 0.18±0.25* 1.23±0.96依肝達中劑量組 1.25±1.05 0±0 0.58±0.60 0.17±0.44* 1.11±0.76依肝達低劑量組 1.63±1.21 0±0 0.73±1.47 0.05±0.15*1.45±1.37

3 討論

肝損傷發生由許多因素引起，如病毒感染、頻繁接觸CCl4等化學性毒物、酗酒和濫用藥物［8-10］等。肝損傷引起肝細胞壞死、膽汁淤積、肝壞死、肝纖維化、肝硬化、肉芽腫性肝炎、脂肪肝、肝血管損害、膽管炎及肝良惡性腫瘤等一系列后果。當肝細胞受損、細胞壞死或者凋亡時，可使細胞內各種酶釋放，使血清中酶活性升高［11］，如丙氨酸氨基轉移酶 （ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶 （AST）。

目前常用的實驗性肝損傷模型有CCl4性肝損傷，D-氨基半乳糖性肝損傷、免疫性肝損傷、醋氨酚性肝損傷、缺血性肝損傷等。其中CCl4性肝損傷模型是篩選保肝降酶藥物最常用模型，其優點是成功率高、方法簡便、穩定性和重復性好、價格低廉。CCl4損傷肝組織的機制是CCl4經肝微粒體細胞色素P450代謝激活后生成自由基三氯甲基（.CCl3），.CCl3可攻擊肝細胞膜上磷脂分子引起脂質過氧化［12］，破壞肝細胞膜結構和功能的完整而使蛋白質等物質合成代謝發生障礙。D-GalN肝損傷模型肝組織病理學特征與人類病毒性肝炎極為相似，是目前公認的比較好的研究病毒性肝炎的發病機制及有效治療藥物的實驗動物模型，當D-GalN進入體內后，與磷酸尿苷（UDP）結合形成UDP-半乳糖胺，致使磷酸尿苷耗竭，從而使依賴其生物合成的核酸、糖蛋白、脂糖等物質合成受抑制，導致肝損傷。此外，D-GalN還可通過產生自由基引起脂質過氧化，造成肝細胞損傷［13］；還可使肥大細胞脫顆粒釋放組胺，造成結腸水腫，使腸源性內毒素吸收增加，引起內毒素中毒損傷肝臟［14］。

依肝達是由壯藥三姐妹、飯湯子、田基黃組成的具有民族特色的復方制劑，具有清熱解毒、利濕退黃、補益正氣和疏通龍路的功效。實驗結果表明，依肝達可以降低CCl4、D-GalN所致急性肝損傷小鼠血清中ALT、AST的水平，并能有效減輕肝組織病理損傷程度，對急性肝損傷小鼠有明顯保護作用，其作用機制可能是通過清除自由基、抑制脂質過氧化，促進肝細胞的核酸，蛋白質、糖原的合成和能量的合成，促進肝臟循環，增強免疫能力等多環節、多靶點綜合作用而保護肝細胞防止肝損傷。

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B

1001-1528（2015）11-2518-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.11.041

2014-06-15

國家 “十一五”科技支撐計劃課題 （2006BAI06A17-03）

李以軍（1970—），男，主管藥師，主要從事中藥臨床藥學研究工作。Tel：13377136390，E-mail：fusuiliyijun@163.com

*通信作者：鄭作文 （1957—），男，碩士，教授，主要從事抗肝炎、抗腫瘤藥物研究。Tel：18977112788，E-mail：zzw_nn@163.com