香參丸對結腸炎大鼠小腸派伊爾結中T細胞亞群及IL-2、TGF-β表達的調節

劉端勇， 徐 榮， 黃敏芳， 王 馨， 鄒 勇， 岳海洋， 趙海梅

（1.江西中醫藥大學科技學院，江西南昌330025；2.江西中醫藥大學研究生院，江西南昌330004；3.江西中醫藥大學基礎醫學院方劑教研室，江西南昌330004）

香參丸對結腸炎大鼠小腸派伊爾結中T細胞亞群及IL-2、TGF-β表達的調節

劉端勇1， 徐 榮2， 黃敏芳2， 王 馨2， 鄒 勇2， 岳海洋2， 趙海梅3*

（1.江西中醫藥大學科技學院，江西南昌330025；2.江西中醫藥大學研究生院，江西南昌330004；3.江西中醫藥大學基礎醫學院方劑教研室，江西南昌330004）

目的 評價香參丸治療實驗性結腸炎療效并探討其作用機制。方法 三硝基苯磺酸（trinitrobenzene sulfonic acid，TNBS）/乙醇法復制實驗性結腸炎，實驗動物隨機分成正常組、模型組、香參丸組及美沙拉嗪組，造模后灌胃給藥7 d，第8天處理，通過腸重指數、結腸長度、肉眼損傷評分評價其療效，同時分別采用流式細胞術和酶聯免疫吸附法檢測大鼠小腸派伊爾結（PP結）中CD4+T、CD8+T淋巴細胞水平以及結腸組織白細胞介素-2（IL-2）、轉化生長因子-β（TGF-β）的量。結果 與模型組比較，香參丸組可明顯縮短結腸長度，降低結腸指數、肉眼下損傷評分、小腸PP結中CD4+T淋巴細胞水平以及結腸組織中IL-2和TGF-β表達水平（P＜0.05或P＜0.01），升高小腸PP結中CD8+T細胞水平，且同時降低CD4/CD8間比例。結論 香參丸有效治療潰瘍性結腸炎的機制可能是通過調節小腸PP結中T淋巴細胞亞群平衡，抑制IL-2和TGF-β表達水平來實現的。

香參丸；結腸炎；T細胞；IL-2；TGF-β

香參丸由苦參、木香組成，出自清代名醫葉天士，其中苦參苦寒，功長清熱燥濕，主要用于治療腸風便血，對熱痢、血痢療效較好［1］，多與木香同用，木香辛開苦降，善行大腸之氣滯，為治療濕熱瀉痢之要藥，二者相配，協同起效，加甘草解毒并緩中健脾，現代常用于治療包括潰瘍性結腸炎在內的各種瀉痢，但其作用機制不明。炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）主要包括潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）和克隆病，目前普遍認為IBD的產生主要來自于黏膜免疫、相關基因和環境因素，而效應T細胞的活化是腸黏膜免疫及其后續炎癥的起點［2-3］。作為腸黏膜免疫系統的重要組織，小腸派伊爾結 （Peyer patch，PP結）主要由T淋巴細胞（以CD4+T淋巴細胞為主）和B淋巴細胞組成，這些細胞在抗原刺激及抗原提呈細胞的作用下活化，并高度表達相應的受體，與對應的配體結合后進入黏膜組織，釋放出炎性因子，介導炎性損傷［4］。為此，本研究采用TNBS/乙醇法復制實驗性結腸炎，并用香參丸干預治療，在觀察其療效同時并探討其對PP結中T淋巴細胞亞群平衡的影響。

1 實驗材料

1.1 動物及分組 清潔級健康雄性SD大鼠40只，體質量200～220 g（由北京維通利華實驗動物有限公司提供），合格證號SCXK（京）2012-0001，隨機分為4組，即正常組、對照組、香參丸組、美沙拉嗪對照組 （陽性對照組），每組10只，適應性飼養3 d后用于實驗。

1.2 主要藥物和試劑 香參丸由苦參 （批號1306056）、廣木香 （批號1308261）、甘草 （批號1308211）組成，中藥配方顆粒購自廣東一方制藥有限公司；美沙拉嗪腸溶片每片0.25 g（葵花藥業生產，批號130407）；TNBS（2，4，6-Trinitrobenzene sulfonic acid solution）分子量為293.17，購于美國SIGMA公司（批號2508-19-2）；FITC-anti-rat CD4+Ab（批號11-0040-82）、APC-anti-rat CD3+Ab（批號17-0030-82）、PE-anti-rat CD8+Ab（批號12-0084-82）購于美國eBioscience公司；IL-2（批號85-BMS634）和TGF-β（批號85-BMS623/3）酶聯免疫吸附試驗試劑盒亦購于美國eBioscience公司。

1.3 主要儀器 酶標儀（Molecular Devices SpectraMax Plus 384）；低溫高速離心機（eppendorf Centrifuge 5430R）；流式細胞儀（美國BD FACSC CantoⅡ）

2 實驗方法

2.1 造模 參考文獻［5］，采用TNBS復制潰瘍性結腸炎

大鼠模型。造模前禁食12 h，除正常組外，所有大鼠用10%的水合氯醛（0.4 g/kg）麻醉［6］后，按100 mg/kg TNBS計算，將TNBS溶入0.3 mL 50%乙醇配制TNBS乙醇復合溶液，用塑料軟管 （直徑約為2mm）將TNBS乙醇復合液注入距肛門約8 cm處，倒置大鼠15min，使藥液到達結腸，然后動物放回原籠自然蘇醒，正常組注入等容積的50%的乙醇溶液，即造模成功。

2.2 給藥 造模24 h后，開始給大鼠灌胃給藥，按體質量換算，香參丸組給予香參丸2.5 g/kg，美沙拉嗪組給予美沙拉嗪0.3 g/kg，空白組及模型組則給予等容積的生理鹽水，每日給藥1次，連續給藥7 d。

2.3 處理方法 給藥7 d后，脫頸椎處死動物，分離距肛門2 cm以上結腸組織，測量其長度，沿縱軸剪開結腸，清除內容物，清洗干凈并吸去水分，稱取結腸質量，將結腸于冰塊上展開，并將腸黏膜向上平鋪于冰塊上固定，觀察炎癥及潰瘍發生情況，按照肉眼觀察結腸黏膜損傷評分標準［7-8］進行結腸損傷評分。同時計算各組老鼠結腸指數，結腸指數=（結腸質量/體質量）×100%，以考察結腸水腫等炎癥表現。

2.4 PP結分離及細胞懸液制備 給藥7 d后，脫椎處死動物后，剖腹剪取全小腸，分離PP結，置于5%FCS RPMI 1640培養液中，300目不繡鋼網碾磨濾過，洗滌2次，3 000 r/min離心，5 min后，棄其上清，混勻定容于1×106后置4℃冰箱保存。

2.5 流式細胞術測CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細胞水平取上述細胞懸液，分別加入0.5uL PE-anti-rat CD8+Ab，FITC-anti-rat CD4+Ab，APC-anti-rat CD3+Ab等熒光標記抗體，室溫下避光孵育30min后，加入1mLPBS洗滌，離心后棄上清，1%多聚甲醛的PBS固定后置4℃冰箱保存，待上機檢測。

2.6 酶聯免疫吸附法檢測結腸局部細胞因子水平 參照試劑盒的說明書檢測結腸組織勻漿中IL-2、TGF-β的量。待測上清液、標準品使用量均為50μL，波長450 nm下測定吸光度值。

2.7 統計學方法 采用SPSS 16.0統計分析軟件處理。計量資料數據以均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗，病理組織記分采用秩和檢驗。以P＜0.05表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 病理學觀察及結腸損傷評分 肉眼下可見模型組結腸黏膜明顯充血、水腫，重度糜爛和多個潰瘍，潰瘍呈圓形或橢圓形，底部干凈，或可見少量淡黃色覆蓋物，邊緣充血水腫；腸重指數、結腸損傷評分明顯高于正常組，結腸長度明顯縮短 （P＜0.01）；治療組亦可見少量充血水腫和部分結腸可見輕度糜爛和潰瘍，潰瘍數目明顯減少并且充血水腫減輕，與模型組比較結腸指數、肉眼下結腸損傷評分明顯下降、結腸腫脹程度明顯減輕，結腸長度顯著延長（P＜0.01或P＜0.05）。提示香參丸治療組可明顯緩解結腸損傷局部充血水腫，減輕炎細胞浸潤程度，抑制潰瘍形成。結果見表1。

3.2 結腸組織中IL-2、TGF-β的表達 由表1可見，模型組大鼠結腸組織IL-2、TGF-β表達水平明顯高于正常組（P＜0.05）；治療組與模型組比較，IL-2和TGF-β表達水平下降，且具有顯著性差異 （P＜0.05或P＜0.01）。

表1 療效評價及IL-2、TGF-β細胞因子的表達

表1 療效評價及IL-2、TGF-β細胞因子的表達

注：與正常組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

分組 腸重指數/% 結腸長度/cm 肉眼下結腸損傷評分 IL-2/（pg.mL-1） TGF-β/（pg.m L-1）0.52±0.03 19.71±1.99 0.3±0.48 0.39±0.17 0.35±0.06模型組 1.02±0.43# 16.19±1.41## 5.89±2.81## 0.58±0.13# 0.45±0.03#香參丸組 0.65±0.08* 17.87±1.46* 2.22±1.39** 0.38±0.08** 0.39±0.05*美沙拉嗪組 0.71±0.12* 16.38±1.31 3.33±2.12* 0.35±0.11** 0.38±0.07正常組*

3.3 流式細胞術測定小腸PP結中CD4+、CD8+T淋巴細胞水平 與正常組比較可見，模型組CD4+T淋巴細胞水平顯著升高，CD8+T淋巴細胞水平顯著降低 （P＜0.05），CD4/CD8T的比值則顯著升高 （P＜0.01）；與模型組比較，各治療組CD4+T淋巴細胞水平均顯著下降，而CD8+T淋巴細胞水平則顯著增加（P＜0.05），因此CD4/CD8T淋巴細胞的比值則明顯降低（P＜0.01或P＜0.05），結果見表2。

表2 大鼠小腸PP結中CD4+、CD8+T淋巴細胞比較

表2 大鼠小腸PP結中CD4+、CD8+T淋巴細胞比較

注：與正常組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

CD4T/CD8正常組分組 CD4+T/% CD8+T/% 34.06±13.99 65.76±16.91 0.52±0.49模型組 57.60±16.56# 35.78±13.41# 1.61±0.56##香參丸組 32.73±1.62* 60.46±12.26* 0.54±0.43**美沙拉嗪組 37.97±14.01 63.35±17.51* 0.60±0.41**

4 討論

在本實驗中，模型組大鼠腸重指數以及肉眼下的結腸損傷評分均較正常組明顯升高，結腸長度明顯縮短，而采用香參丸灌胃治療后腸重指數及損傷評分均明顯降低，而結腸長度顯著延長，說明香參丸能有效緩解實驗性結腸炎的炎癥損傷程度和潰瘍形成。

腸黏膜免疫功能紊亂與UC發病密切相關，來自PP結的T淋巴細胞進入腸粘膜固有層失衡并活化，發揮效應作用，因此觀察其T淋巴細胞平衡是監控黏膜免疫狀態的重要手段［5］。本實驗結果表明，香參丸可明顯降低結腸炎大鼠小腸PP結中CD4+T淋巴細胞水平，升高CD8+T淋巴細胞水平，同時下調CD4/CD8比值，其原因可能是某些方面結腸局部致病性T淋巴細胞增多，免疫功能紊亂，且在此實驗中，炎性因子IL-2和TGF-β分泌增多，IL-2作為重要的促炎細胞因子，要由活化的Th1細胞或CD4+T細胞分

泌，與單核巨噬細胞、B細胞及T細胞表面的IL-2受體結合后，能夠誘導自然殺傷 （NK）細胞生成并增強其活性；引起T細胞增殖、活化；促進細胞毒T細胞的殺傷作用［7-9］。因此，IL-2對于自身免疫調節具有重要意義。TGF-β是一種有效的免疫抑制因子，TGF-β水平的下降，將有利于淋巴細胞的激活，這將促進自身抗體和自身致敏T細胞的產生，誘導自身免疫反應，導致炎性免疫損傷［10-12］。TGF-β主要在結腸黏膜固有層的炎細胞如中性粒細胞、淋巴細胞及漿細胞中表達，TGF-β在正常結腸粘膜中的表達很弱，而在UC中表達明顯增強［13-14］。本研究表明模型組大鼠結腸組織中IL-2和TGF-β的水平均明顯升高，經過香參丸治療后，結腸炎大鼠結腸組織中IL-2和TGF-β表達下降。此表明香參丸治療UC的機制之一可能是通過調節腸黏膜局部T淋巴細胞亞群平衡，抑制促炎因子IL-2和TGF-β的表達，從而抑制異常免疫反應，減輕免疫損傷，促進潰瘍愈合。

［1］ 許紅蘭.苦參的藥理研究進展［J］.現代醫藥衛生，2008，24（20）：3066-3067.

［2］ Brayden D J，Baird AW.Apicalmembrane receptors on intestinal M cells：potential targets for vaccine delivery［J］.Adv Drug Deliv Rev，2004，56（6）：721-726.

［3］ 原雪琦，孫 進，常桂芳，等.10株乳酸菌黏附小鼠派伊爾結及免疫調節作用研究［J］.中國微生態學雜志，2009，21（7）：577-580.

［4］ 范 駿.腸道黏膜免疫［J］.國際免疫學雜志，2006，29（2）：111-115.

［5］ Segain JP，Raingeard de la Blétière D，Sauzeau V，etal.Rho kinase blockade prevents inflammation via nuclear factor kappa B inhibition：evidence in Crohn’s disease and experimental colitis［J］.Gastroenterology，2003，124（5）：1180-1187.

［6］ 康愛君，張 闊，田 楓，等.戊巴比妥鈉、水合氯醛、氨基甲酸乙酯麻醉對雄性SD大鼠血液學指標的影響［J］.中國比較醫學雜志，2008，18（4）：61-63.

［7］ Schmidt N，Gonzalez E，Visekruna A，etal.Targeting the proteasome：partial inhibition of the proteasomeby bortezomib or deletion of the immunosubunit LMP7 attenuates experimental colitis［J］.Gut，2010，59（7）：896-906.

［8］ 劉端勇，黃小英，程紹民，等.四神丸對實驗性結腸炎結腸組織Bax/Bcl-2mRNA，Fas/FasL的調控作用［J］.中國中藥雜志，2011，36（24）：3484-3488.

［9］ 謝 力，邢之華，蔣榮鑫.三皮湯對小鼠潰瘍性結腸炎模型IL-2和IL-10表達的影響［J］.中國實驗方劑學雜志，2009，15（9）：67-70.

［10］ 王 燕，朱向東，段永強，等.四神丸對潰瘍性結腸炎大鼠結腸組織病理形態及血清抗炎、促炎因子平衡的影響［J］.中醫研究，2014，27（1）：53-55.

［11］ Fichtner-Feigl S，Fuss IJ，Young C A，et al.Induction of IL-13 triggers TGF-betal-dependent tissue fibrosis in chronic 2，4，6-trinitrobenzene sulfonic acid colitis［J］.J Immunol，2007，178（9）：5859-5870.

［12］ Ask K，Bonniaud P，Maass K，et al.Progressive pulmonary fibrosis ismediated by TGF-βisoform 1 but not TGF-β3［J］.Int JBiochem Gell Biol，2008，40（3）：484-495.

［13］ 安彩萍，馬曉凡，吳煥淦，等.TGF-β/CTGF在腸纖維化機制中的作用［J］.世界華人消化雜志，2008，16（19）：2137-2143.

［14］ 廖澤云，李玉山，姜錦林，等.番石榴葉提取物對三硝基苯磺酸誘導大鼠結腸炎結腸組織的保護作用［J］.世界華人消化雜志，2007，15（1）：69-71.

R285.5

B

1001-1528（2015）11-2524-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.11.043

2014-11-10

國家自然科學基金項目 （81460679，81260595）；江西省自然科學基金項目 （20122BAB215046）

劉端勇 （1975—），男，博士，副教授，從事潰瘍性結腸炎與中藥免疫藥理研究。Tel：（0791）86588407，E-mail：liuduanyong@163.com

*通信作者：趙海梅 （1979—），女，博士，副教授，研究方向為潰瘍性結腸炎與中藥免疫藥理。Tel： （0791）86588407，E-mail：haimei79@163.com