黃芩素對A375細胞黑素合成的抑制作用及相關細胞信號通路調控的初步研究

陳 晨， 徐艷明， 王 雪， 耿 放， 劉國良， 雷雙媛， 張 寧

（1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江哈爾濱150040；2.哈爾濱師范大學，黑龍江哈爾濱150025）

黃芩素對A375細胞黑素合成的抑制作用及相關細胞信號通路調控的初步研究

陳 晨， 徐艷明， 王 雪， 耿 放*， 劉國良， 雷雙媛， 張 寧*

（1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江哈爾濱150040；2.哈爾濱師范大學，黑龍江哈爾濱150025）

目的 研究黃芩素對體外培養的A375細胞黑素合成的影響及絲裂原活化蛋白激酶 （MAPK）信號通路與該作用的相關性。方法 用黃芩素處理A375細胞，采用四甲基噻唑藍 （MTT）法測定A375細胞的活性，NaOH法測定黑素量，多巴氧化法測定酪氨酸酶（TYR）活性，RT-PCR法測定TYR、酪氨酸酶相關蛋白-1（TRP-1）和TRP-2以及MAPK信號通路關鍵蛋白激酶ERK1、ERK2、JNK2的mRNA表達。結果 0.1～0.001μmol/L的黃芩素可明顯抑制A375細胞黑素合成及TYR活性，0.1μmol/L黃芩素明顯下調A375細胞TYR、TRP-1、TRP-2 mRNA表達，以及ERK1、ERK2、JNK2 mRNA表達。結論 黃芩素具有抑制A375細胞的黑素合成的作用，其機制可能與抑制TYR活性和/或下調TYR、TRP-1及TRP-2 mRNA表達，以及抑制ERK1、ERK2、JNK2的表達有關。

黃芩素；A375細胞；黑素；MAPK信號通路

黑素代謝障礙是黃褐斑產生的主要病機。黑素在黑素細胞內由酪氨酸經酪氨酸酶氧化而合成，酪氨酸酶 （TYR）過表達導致黑素合成亢進。近年來研究發現，MAPK信號通路參與了黑素細胞中黑素生成的調控，在調節黑素細胞生理活動及功能方面發揮重要作用［1］。Jang Ji Yeon［2］等體外培養鼠B16 F10黑素瘤細胞發現，甘松提取物能夠誘導MEK/ERK磷酸化和PI3K/Akt信號激活，抑制環磷酸腺苷（cAMP）表達水平來下調小眼畸形轉錄因子（MITF）和TRP蛋白表達，從而抑制TYR活性，抑制黑素的合成。杜仲是青娥方中君藥，能夠使未成熟小鼠子宮質量增加，陰道細胞角化提前進入動情周期，促使未成熟小鼠靶器官發育，發揮雌激素樣作用［3］。黃芩素是杜仲的有效成分，屬雌激素類化合物。李曉紅等［4］通過研究發現黃芩素能夠誘導雌激素反應元件 （ERE）的激活來下調MITF蛋白表達，對TYR活性有抑制作用，從而降低黑素合成起到脫色素作用。雌激素受體 （ER）的生理作用與MAPK信號通路的轉導密切相關，MAPK家族主要包括三個亞家族—細胞外調節蛋白激酶（ERK1/2）、c-JunN末端蛋白激酶（JNK1/ 2）和p38蛋白激酶 （p38 MAPK）［5］。因此，本研究探討黃芩素對黑素細胞黑素分泌的調節作用以及與MAPK信號通路的相關性，初步確定黃芩素對黃褐斑的潛在治療作用及作用機制。

1 材料與儀器

1.1 材料 人黑素瘤細胞A375（中國科學院細胞中心提供）；DMEM培養液（美國Gibco生物公司）；二甲基亞砜DMSO（美國Sigma公司）；四甲基噻唑藍MTT（美國Sigma公司）；Trizol細胞裂解液 （美國 Gibco生物公司）；焦碳酸二乙酯（DEPC） （美國Gibco生物公司）；PCR試劑盒（上海生工生物工程技術服務有限公司）。

1.2 儀器 TGL-16G-C型高速臺式冷凍離心機（上海安亭科學儀器廠），PCR擴增儀 （德國Biometra公司），酶標儀 （上海熱電儀器有限公司），Olympus倒置顯微鏡（日本Olympus株式會社），Heλiosγ可見紫外分光光度計 （美國熱電公司），DYYOC型電泳儀 （北京市六一儀器廠），Cham1Ge15000凝膠成像系統 （北京賽智創業科技有限公司）。

1.3 藥品 黃芩素購于南京澤朗科技有限公司，純度98%，批號為491678120525；雌二醇購于中國食品藥品檢定研究院，純度98%，批號為150-28-21。

2 實驗方法

2.1 藥液配制 精密稱取雌二醇5.5 mg，用4 mL無水乙醇溶解，配制成20μmol/L的原液，實驗前再用DMEM完全培養液稀釋至0.001μmol/L，待用。精密稱取黃芩素5.4 mg，用DMEM完全培養液溶解，配制成200μmol/L的原液，實驗前再梯度稀釋成0.001～100μmol/L的6種藥液，待用。

2.2 細胞分組與處理 選取對數生長期的A375細胞常規消化，計數，以3×103個/孔接種細胞于96孔培養板上，每孔200μL，24 h后，分別設空白對照組、陽性對照組（0.001μmol/L的雌二醇）、黃芩素組 （設定濃度的黃芩素），各組設6個復孔。將另一部分細胞以9×104個/孔接種細胞于6孔培養板中，每孔2 mL，分組處理同前，每組設4個復孔。培養48 h后，分別進行MTT實驗、黑素含量實驗、TYR活性實驗、RT-PCR實驗。

2.3 指標檢測

2.3.1 細胞活性 向96孔板各孔加20μL MTT（5 mg/mL），繼續培養4 h，棄上清，每孔加入150μL DMSO振蕩10 min，選擇490 nm在酶標儀上測定各孔吸光度值。細胞增值率用D490表示。

細胞增值抑制率=D490給藥/D490空白×100%

2.3.2 黑素含量 棄掉6孔板培養液，PBS洗2次，每孔加入1 mL 0.25%胰酶消化10 min后，再加入1 mL DMEM培養液終止消化，收集各組細胞懸液至15 mL離心管中，1 500 r/min離心3 min，棄上清，加入1 mol/L的NaOH溶液100μL，混勻，37℃水浴1 h，加入400μL雙蒸水，混勻，從每支離心管中取出100μL溶液加至96孔板中，選擇490 nm在酶標儀上測定各孔吸光度值。黑素合成用D490表示。

2.3.3 TYR活性 棄掉96孔板培養液，PBS洗2次，每孔加入1%Triton X-100溶液100μL，迅速將其置于-80℃冰箱中30 min，取出室溫融化。每孔加入50μL預熱的0.2%左旋多巴（L-dopa）溶液，37℃下反應3 h，選擇490 nm在酶標儀上測定各孔吸光度值。TYR活性用D490表示。

2.3.4 RT-PCR法檢測細胞TYR、TRP-1、TRP-2、ERK1、ERK2、JNK2 mRNA表達 收集6孔板中各組細胞，按照Trizol說明書提取總RNA，各組以RNA 3μg進行反轉錄。反應條件：25℃反應10 min，42℃反應60 min，70℃反應10 min終止反應，得到cDNA。引物序列由上海生工生物工程技術服務有限公司設計與合成，以β-actin為內參照，引物序列信息見表1。

表1 RT-PCR引物序列Tab.1 Primer sequences of RT-PCR

擴增條件：94℃預變性時間2 min；94℃變性30 s、退火40 s（TYR 54℃、TRP-1 57℃、TRP-2 55℃、ERK1 57℃、ERK2 54℃、JNK2 54℃、βactin 54℃）、72℃延伸40 s，35個循環；72℃終止延伸10 min。PCR擴增產物5μL與6×DNA loading buffer 1μL混勻，加入1.5%瓊脂糖凝膠中，80 V恒壓電泳30 min后，凝膠成像系統觀察電泳結果，應用gel-pro凝膠分析軟件對電泳譜帶進行分析，用校正值（TYR/β-actin、TRP-1/β-actin、TRP-2/β-actin、ERK1/β-actin、ERK2/β-actin、JNK2/β-actin）表示mRNA水平。

2.4 統計學方法 實驗數據用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析（ANOVA），用LSD法對數據進行兩兩比較。P＜0.05具有統計學意義。

3 結果

3.1 對細胞活性的影響 結果見表2，與空白對照組相比，100、10、1μmol/L的黃芩素對細胞的增殖有顯著抑制作用 （P＜0.05或P＜0.01），說明上述劑量的藥物對細胞有毒性作用，不適合進行下一步的藥效學研究；0.1、0.01、0.001μmol/L的黃芩素不影響細胞活性。

3.2 對黑素合成的影響 結果見表3，與空白對照組相比，黃芩素組給藥劑量為 0.1、0.01、0.001μmol/L時，對黑素合成有顯著的抑制作用（P＜0.05或P＜0.01）；陽性對照組對黑素合成有極顯著的促進作用 （P＜0.01）。

3.3 對TYR活性的影響 結果見表4，與空白對照組相比，黃芩素組給藥劑量為 0.1、0.01、0.001μmol/L時，對TYR活性有極顯著的抑制作用（P＜0.01）；陽性對照組對TYR活性有極顯著的促進作用 （P＜0.01）。

3.4 對細胞TYR、TRP-1、TRP-2 mRNA表達的影響

表2 黃芩素對A375細胞活性的影響 （，n=6）Tab.2 Effects of bicalein on the activity of A375 cells（，n=6）

表2 黃芩素對A375細胞活性的影響 （，n=6）Tab.2 Effects of bicalein on the activity of A375 cells（，n=6）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 劑量/（μmol·L-1） 吸光度值 細胞增殖率/% 0.336±0.025 100陽性對照組 0.001 0.339±0.036 101黃芩素組 100 0.124±0.012** 37**黃芩素組 10 0.279±0.024** 83**黃芩素組 1 0.300±0.047* 89*黃芩素組 0.1 0.329±0.023 98黃芩素組 0.01 0.319±0.033 95黃芩素組空白對照組-0.001 0.326±0.041 97

表3 黃芩素對A375細胞黑素合成的影響 （，n=4）Tab.3 Effects of baicalein on the synthesis of melanocytes of A375（，n=4）

表3 黃芩素對A375細胞黑素合成的影響 （，n=4）Tab.3 Effects of baicalein on the synthesis of melanocytes of A375（，n=4）

組別 劑量/（μmol·L-1） 吸光度值 與空白組D比值/% - 0.074±0.003 100陽性對照組 0.001 0.093±0.006** 125**黃芩素組 0.1 0.060±0.006** 81**黃芩素組 0.01 0.063±0.004** 85**黃芩素組 0.001 0.065±0.002* 88空白對照組*

注：與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01表4 黃芩素對A375細胞TYR活性的影響（，n=6）Tab.4 Effect of baicalein on TYR activity of A375 cells（，n=6）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01表4 黃芩素對A375細胞TYR活性的影響（，n=6）Tab.4 Effect of baicalein on TYR activity of A375 cells（，n=6）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 劑量/（μmol·L-1） 吸光度值 與空白組D比值%空白對照組- 0.079±0.002 100陽性對照組 0.001 0.096±0.003** 121**黃芩素組 0.1 0.068±0.004** 86**黃芩素組 0.01 0.069±0.002** 87**黃芩素組 0.001 0.070±0.002** 88**

結果見表5和圖1，與空白對照組相比，黃芩素組（0.1μmol/L）TYR、TRP-1、TRP-2的mRNA的表達均明顯降低（P＜0.05或P＜0.01），陽性對照組TYR、TRP-1、TRP-2的mRNA表達均明顯增強（P＜0.01）。

表5 TYR、TRP-1、TRP-2 m RNA的RT-PCR產物凝膠電泳定量分析結果（，n=4）Tab.5 Quantitative analysis of gel electrophoresis results on the RT-PCR products of TYR、TRP-1、TRP-2 mRNA（，n=4）

表5 TYR、TRP-1、TRP-2 m RNA的RT-PCR產物凝膠電泳定量分析結果（，n=4）Tab.5 Quantitative analysis of gel electrophoresis results on the RT-PCR products of TYR、TRP-1、TRP-2 mRNA（，n=4）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

-actin空白對照組組別 劑量/（μmol·L-1） TYR/β-actin TRP-1/β-actin TRP-2/β 0.602±0.013 0.534±0.032 0.574±0.089陽性對照組 0.001 0.859±0.062** 0.698±0.065** 0.845±0.046**黃芩素組 0.1 0.499±0.025* 0.235±0.040** 0.437±0.035 -*

注：a.陽性對照組；b.黃芩素組（0.1μmol/L）；c.空白對照組；A.β-actin與TYR的PCR結果；B.β-actin與TRP-1的PCR結果；C.β-actin與TRP-2的PCR結果

3.5 對細胞ERK1、ERK2、JNK2 mRNA表達的影響 結果見表6和圖2，與空白對照組相比，黃芩素組（0.1μmol/L）ERK1、ERK2、JNK2的mRNA表達均明顯降低 （P＜0.05），陽性對照組ERK1、ERK2、JNK2的mRNA表達均明顯增強（P＜0.01）。

圖2 黃芩素對A375 ERK1、ERK2、JNK2 m RNA表達水平的影響Fig.2 Effects of baicalein on themRNA expression levels of ERK1，ERK2，JNK2 in A375 cells

表6 ERK1、ERK2、JNK2 m RNA的RT-PCR產物凝膠電泳定量分析結果（，n=4）Tab.6 Quantitative analysis of gel electrophoresis results on the RT-PCR products of ERK1，ERK2，JNK2 mRNA（，n=4）

表6 ERK1、ERK2、JNK2 m RNA的RT-PCR產物凝膠電泳定量分析結果（，n=4）Tab.6 Quantitative analysis of gel electrophoresis results on the RT-PCR products of ERK1，ERK2，JNK2 mRNA（，n=4）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

-actin空白對照組組別 劑量/（μmol·L-1） ERK1/β-actin ERK2/β-actin JNK2/β 0.326±0.035 0.517±0.018 0.321±0.013陽性對照組 0.001 0.485±0.006** 0.853±0.087** 0.483±0.036**黃芩素組 0.1 0.272±0.014* 0.410±0.012* 0.271±0.013 -*

4 討論

黃褐斑是一種常見的獲得性色素沉著性皮膚病，黑素在皮膚內的增多是導致黃褐斑產生的主要原因［6］。黑素生成及代謝的任何一個環節發生改變，都可引起色素障礙性皮膚病。人體內黑素在黑素細胞黑素體中合成，其合成受酪氨酸酶（TYR）、酪氨酸酶相關蛋白-1（TRP-1）和TRP-2調控，TYR在黑素合成過程中起到關鍵限速酶的作用，而TRP-1和TRP-2在黑素生物合成途徑下游起作用［7-9］。人黑素細胞合成黑素的量取決于酪氨酸酶的活性水平，降低酪氨酸酶活性可阻止皮膚黑素生成，能夠抑制酪氨酸酶活性并減少黑素生成

的藥物可以提高黃褐斑的治療效果［10］。在黑素瘤A375細胞中存在著雌激素受體 （ER），雌激素作為一種細胞外信號，其發揮作用的途徑一般是與ER結合，MAPK信號通路是細胞外信號引起細胞生理反應的共同途徑。雌激素通過皮膚細胞ER對黃褐斑的產生有調節作用，而植物雌激素有類雌激素作用。黃芩素作為一種植物雌激素能夠抑制MCF-7和MDA-MB-231細胞增殖并且誘導細胞凋亡［11］。因此，選擇具有雌激素樣作用成分黃芩素來進行治療黃褐斑的研究。

實驗表明，黃芩素安全劑量作用于A375細胞后，能顯著抑制細胞黑素合成及TYR活性且呈正相關，抑制A375細胞中TYR、TRP-1、TRP-2的mRNA表達，提示黃芩素可能通過抑制TYR活性和/或抑制TYR、TRP-1、TRP-2 mRNA表達抑制黑素合成，并且黃芩素能顯著抑制MAPK信號通路蛋白激酶ERK1、ERK2、JNK2的mRNA表達，推測MAPK信號通路可能參與了黑素細胞中黑素生成的調控。

現在醫學中常用的脫色劑等雖對黃褐斑有一定的療效，但長期應用容易產生毒副作用。中藥因其毒副作用小，療效較好，受到越來越多的關注。陳龍等［12］通過研究發現養顏青娥丸對黑素細胞的增殖以及酪氨酸酶的活性有抑制作用，對黑素合成的量也有降低作用，認為養顏青娥丸具有治療黃褐斑的作用。養顏青娥丸處方中的君藥杜仲對黑素細胞增殖及酪氨酸酶活性有抑制作用且對黑素合成有降低作用，對黃褐斑有一定的治療作用［12］。李洪武［13］等用中波紫外線 （UVB）誘導豚鼠背部膚色素沉著后用白術、茯苓、山茱萸等乙醇提取物治療，可顯著抑制TYR活性，茯苓、白術乙醇提取物能在基因轉錄水平下調豚鼠皮膚酪氨酸酶mRNA表達抑制酶蛋白生物合成。我們通過從ER信號通路角度，探索植物雌激素成分黃芩素對相關細胞信號通路的調控作用，推測中藥植物雌激素治療黃褐斑的分子機制，探討黃芩素對黃色斑等色素性皮膚病可能具有的治療作用，為合理利用中藥植物雌激素防治黃褐斑等皮膚色素沉著疾病提供理論基礎，更好的指導臨床用藥。

［1］ 姜澤群.幾種中藥有效成分促黑色素生成的機制研究［D］.武漢：華中科技大學，2009.

［2］ Jang JY，Kim H N，Kim Y R，et al.Partially purified components of Nardostachys chinensis suppress melanin synthesis through ERK and Aktsignaling pathway with cAMP down-regulation in B16F10 cells［J］.J Ethnopharmacol，2011，137（3）：1207-1214.

［3］ Xu Y，Zhang Z J，Geng F，et al.Treatmentwith Qing'E，a kidney invigorating Chinese herbal formula，antagonizes the estrogen decline in ovariectomized mice［J］.Rejuvenation Res，2010，13（4）：497-488.

［4］ 李曉紅，栗玉珍，黨 林，等.黃芩素通過ERK途徑抑制黑素生成 ［C］//中華醫學會第16次全國皮膚性病學術年會摘要集.廣州：中華醫學會皮膚性病學分會，2010.

［5］ Cohen P.The search for physiological substrates of MAP and SAP kinases in mammalian cells［J］.Trends Cell Biol，1997，7（9）：353-361.

［6］ Cayce K A，Mcmichael A J，Feldman S R.Hyperpigmentation：an overview of the common afflictions［J］.Dermatol Nurs，2004，16（5）：401-406，413-416，417.

［7］ Hashimoto Y，Ito Y，Kato T，et al.Expression profiles of melanogenesis-related genes and proteins in acquired melanocytic nevus［J］.JCutan Pathol，2006，33（3）：207-215.

［8］ Lu F，Yan D，Zhou X，et al.Expression ofmelanin-related genes in cultured adult human retinal pigment epithelium and uveal melanoma cells［J］.Mol Vis，2007，13（3）：2066-2072.

［9］ Fang D，Kute T，Setaluri V.Regulation of tyrosinase-related protein-2（TYRP-2）in human melanocytes：relationship to growth and morphology［J］.Pigment Cell Res，2001，14（2）：132-139.

［10］ 趙玲玲，張理平.抑制酪氨酸酶藥物研究新進展［J］.海峽藥學，2009，21（12）：124-126.

［11］ 徐維恒，肖 雷，馬宜明.黃芩素對乳腺癌細胞MCF-7和MDA-MB-231增殖的影響［J］.中國藥師，2011，14（1）：26-28.

［12］ 陳 龍，鄭 義，高 進，等.養顏青娥丸對小鼠B16黑素瘤細胞株黑素合成和酪氨酸酶的影響［J］.中國醫院藥學雜志，2002，22（3）：151-153.

［13］ 李洪武，朱文元，夏明玉，等.白術及茯苓提取物對豚鼠皮膚酪氨酸酶mRNA基因表達水平的影響［J］.中華皮膚科雜志，2001，34（2）：134-135.

Inhibitory effect of melanogenesis in A375 cells and related cell signaling pathways regulating m echanism of baicalein

CHEN Chen， XU Yan-ming， WANG Xue， GEN Fang*， LIU Guo-liang， LEI Shuang-yuan，ZHANG Ning*

（1.Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 15OO4O，China；2.Harbin Normal University，Harbin 15OO25，China）

AIM To study the effects of baicalein on melanogenesis and investigate the relationship between MAPK signal pathway and the role in A375 cell lines.METHODS The A375 cell lineswere treated with baicalein.Effects of baicalein on cell viability，tyrosinase（TRY）activity and melanogenesis in cultured A375 cells were measured by MTTmethod，NaOH method and L-dopa oxidation method，respectively.RT-PCR wasapplied to measuring themRNA expression levels of（TYR）and tyrosinase related proteins and themRNA expression levels of ERK1，ERK2 and JNK2.RESULTS 0.1～0.001μmol/L baicalein can significantly inhibitmelanin synthesis and TYR activities in A375 cell lines.Baicalein（0.1μmol/L）can significantly inhibit TYR，TRP-1，TRP-2 mRNA and ERK1，ERK2，JNK2 mRNA expression levels.CONCLUSION It is assumed that baicalein can significantly suppressmelanogenesis of A375 cells.The possiblemolecularmechanism of baicalein inhibitingmelanin synthesismay be by cutting TYR，TRP-1 and TRP-2 mRNA expression quantity and associating with the inhibi-

baicalein；A375 cells；melanin；MAPK signal pathway

R966

A

1001-1528（2015）12-2600-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.12.006

2014-07-15

國家自然科學基金面上項目 （81274035）；黑龍江省自然科學基金面上項目 （D201234）；黑龍江省博士后科研啟動金（LBH-Q13162）；黑龍江中醫藥大學優秀創新人才支持計劃資助 （2012）

陳 晨（1991—），女，碩士生，主要從事中藥理學研究。Tel：（0454）6050350，E-mail：chenchen1208@yeah.net

*通信作者：張 寧 （1974—），男，博士，副教授，主要從事中藥藥效物質基礎及體內代謝研究。Tel：（0454）6050350，E-mail：zhangning0454@163.com耿 放 （1981—），女，博士，副教授，碩士生導師，主要從事天然藥物活性成分研究。Tel：（0451）82475863，Email：gengfang1980@163.com

日期：2014-10-17

網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/31.1368.R.20141017.1200.001.html

tion of the expression of ERK1、ERK2 and JNK2.