蒙醫尼如哈優化劑對結腸炎相關性結腸癌模型小鼠血清及結腸組織中氣體信號分子體系的影響

布圖雅， 肖 瑞， 烏日罕， 娜日格樂

（1.內蒙古醫科大學蒙醫藥學院，內蒙古呼和浩特010070；2.內蒙古醫科大學基礎醫學院，內蒙古呼和浩特010070；3.錫盟蒙醫醫院，內蒙古 錫林浩特026000；4.內蒙古醫科大學，內蒙古 呼和浩特010050）

蒙醫尼如哈優化劑對結腸炎相關性結腸癌模型小鼠血清及結腸組織中氣體信號分子體系的影響

布圖雅1， 肖 瑞2， 烏日罕3， 娜日格樂4

（1.內蒙古醫科大學蒙醫藥學院，內蒙古呼和浩特010070；2.內蒙古醫科大學基礎醫學院，內蒙古呼和浩特010070；3.錫盟蒙醫醫院，內蒙古 錫林浩特026000；4.內蒙古醫科大學，內蒙古 呼和浩特010050）

目的 通過觀察蒙醫尼如哈優化劑對氧化偶氮甲烷 （AOM）/葡聚糖硫酸鈉 （DSS）誘導的CAC小鼠NO、一氧化氮合酶 （iNOS）、CO、血紅素氧合酶 （HO-1）、硫化氫 （H2S）及胱硫醚-γ-裂解酶 （CSE）體系的影響，探討蒙醫尼如哈優化劑對CAC的干預及其部分作用機制。方法 將56只Balb/c雄性小鼠隨機分為空白組、模型組、柳氮磺吡啶組、傳統組、高劑量組、中劑量組、低劑量組等，采用AOM+DSS法造模，造模完成后各組進行相應處理，檢測CAC小鼠血清及結腸組織中NO、iNOS、CO、HO-1、H2S及CSE的量。結果 模型組的NO、iNOS、CO、HO-1、H2S及CSE的量高于正常組，P＜0.05；高劑量組對NO、iNOS、CO、HO-1、H2S及CSE的下調作用最為明顯，P＜0.017。結論 蒙醫尼如哈優化劑可降低CAC小鼠血清及結腸組織中NO、iNOS、CO、HO-1、H2S及CSE的量，起到保護腸黏膜的作用。

蒙醫；尼如哈優化劑；潰瘍性結腸炎相關性結腸癌；氣體信號分子體系

潰瘍性結腸炎相關癌（ulcerative colitis-associated cancer，CAC）是在潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）背景下發生的大腸癌即炎癥相關癌［1］，臨床資料提示其發病率目前低于結腸癌，發病率為0.6%～17%［2］，臨床以腹痛、腹瀉、黏液膿便、血便為主要特征。隨著炎癥的進展，潰瘍性結腸炎發生癌變的危險累計率增高，病史為10、20、30年的 UC患者發生癌變的危險性依次為2%、8%、18%［3］，但是，由于UC的發病原因不明，加之目前所應用的美沙拉嗪、5-氨基水楊酸等藥物的毒副作用較大，尋求安全有效的治療藥物及方法已成為目前研究熱點。

隨著內源性氣體信號分子相關研究的深入，其生物學效應越來越受到學術界的關注。研究發現，過量產生的NO可誘發 DNA鏈斷裂、基因突變，細胞凋亡、腫瘤的發生［4］，iNOS在此過程中也起主要作用［5］。正常情況下，對胃腸道運動有著調節作用的CO在腸道極少表達，只是在炎癥細胞、白介素-1等的誘導下，產生大量的CO。其主要限速酶HO-1具有抗炎癥、抗凋亡、抗增生作用，是對腸道的一種保護機制［6］。另有研究表明，高水平的H2S可能通過誘發上皮細胞的功能紊亂而促使UC的發展或腸上皮細胞的惡性轉化［7］。可見，上述氣體信號分子對結腸的炎癥及癌變都有一定影響。

CAC屬蒙醫大腸 “血痞病”范疇，即寶如熱邪易積于大腸，久病借 “赫依”之作用凝結致痞。赫依 （“氣”）與血為其主要病因。蒙醫認為，赫依是人體賴以進行生命活動的3種能量和基本物質之一。從陰陽角度解釋，它有兩面性，從五元學說角度看屬 “氣”。而大腸的生理、病理改變與赫依緊密相關。盡管治療大腸病變的方藥和療術療法繁多，但均以調和赫依 （“氣”）為要。基于此，我們 提出 “氣”與氣體信號分子具有相關性乃至對應性的假設，采用具有軟化和消除腫瘤功效［8］的尼如哈療法 （是蒙醫的一種傳統外治療法，將蒙藥合理配伍成煎劑進行灌腸治療），觀察以鎮赫依 （“氣”）為主要功效的尼如哈優化劑對CAC的干預并闡明其部分作用機制，以供臨床。

通過前期研究我們發現，模型組小鼠結腸肉眼改變以散在、多發性息肉狀隆起性病變為主，病理改變以低級別上皮內瘤變和/或高級別上皮內瘤變 （重度不典型增生及原位腺癌）為主；優化劑低、中劑量組肉眼改變均以伴有單發或少數息肉狀隆起性病變為主，偶伴潰瘍形成，鏡下以增生性息肉改變為主，偶見異常隱窩；優化劑高劑量組肉眼改變均以結腸黏膜充血、水腫為主，鏡下改變均以黏膜上皮脫落、以腺體增生為主，未見潰瘍及明顯的異常隱窩、上皮內瘤變。與模型組比較有極顯著差異 （P＜

0.01）。下面，我們將著重探討優化劑對CAC小鼠結腸黏膜保護作用的部分機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 清潔級雄性Balb/c小鼠56只，平均體質量 （20±2）g。 （北京華阜康生物科技有限公司，許可證號：SCXK［京］2009-0004）。

1.1.2 主要試劑 葡聚糖硫酸鈉 （DSS，分子量為50 000）（美國AMERESCO公司，貨號0918-10g）；氧化偶氮甲烷（AOM）（美國SIGMA公司，貨號A5486-25MG）；石蠟油（美國AMERESCO公司，貨號MJ217-100 mL）；NO試劑盒（美國RD公司，貨號DZE20293）；CO試劑盒 （南京建成生物工程研究所，貨號A101-3）；H2S試劑盒 （美國RD公司，貨號DZE20054）；iNOS試劑盒（美國RD公司，貨號DZE20450）；HO-1試劑盒 （美國 RD公司，貨號DZE20472）；CSE試劑盒 （美國 RD公司，貨號DZE20052）。

1.1.3 主要儀器 電熱恒溫培養箱 （DH4000A，天津泰斯特）；高速冷凍離心機 （HC-3018R，安徽中科中佳科學儀器有限公司）；全自動多功能酶標儀（MULTISKAN MK3，Thermo，USA）；MINI shaker（MH-1，kylin-Bell Lab Instruments QILINBEIER）；紫外分光光度計（UV-2000，上海尤尼柯公司）。

1.1.4 實驗藥物及制備 尼如哈傳統劑，處方由訶子、茜草、枇杷葉、藜蘆、秦艽花、大黃組成，載于 《甘露四部》，購自內蒙古醫科大學附屬中蒙醫院。制備法：稱重，粉碎，梯度 （100～250目孔）過篩成粉末狀，蒸餾水煮沸后靜置，取上清液備用。

尼如哈優化劑：訶子、石榴、蓽茇等組成的15味方藥。購自內蒙古醫科大學附屬中蒙醫院。制備法同傳統劑。

柳氮磺吡啶腸溶片 （國藥準字 H31020840，批號22120608，上海福達制藥有限公司），蒸餾水稀釋應用。

1.2 模型建立和分組 將所有Balb/c小鼠在晝夜循環（12 h∶12 h），恒濕 （50±10）%，恒溫 （22±2）℃條件下適養1周。按體質量隨機分為空白組、模型組、柳氮磺吡啶組、傳統組、高劑量組、中劑量組、低劑量組等；各組8只。除空白組 （腹腔注射等量的生理鹽水）外，將質量濃度為1 g/L溶于生理鹽水中的AOM以10 mg/kg腹腔注射一次，連續飲用一周3%DSS（分子量50 000）溶液，繼之連續喂養2周普通飲用水 （上述過程為一個循環），共重復三個循環［9］。

1.3 實驗方法 實驗第10周開始，將空白組與模型組給予等量的生理鹽水灌腸；柳氮磺吡啶組以3%柳氮磺吡啶灌腸；傳統尼如哈，450 mg/mL質量濃度給予傳統組灌腸；尼如哈優化劑分別以450、225、112.5 mg/mL給高劑量組、中劑量組、低劑量組灌腸。經肛門插入，距肛門3 cm處注入藥物，為了使藥物充分流在結腸內將小鼠倒立3 min。每日灌腸一次，量為0.2 mL/20 g，療程為11周。

直至療程結束后，將小鼠禁食12 h，不禁水。進行摘眼球采血（3 500 r/min、4℃離心20 m in后取血清，儲存于-20℃），處死后取整段結腸，沿腸系膜剖開，用生理鹽水洗凈，濾紙吸干后，-80℃液氮中保存。

1.4 檢測指標

1.4.1 血清檢測 CO的量測定：采用比色法。NO及H2S的量測定：采用酶聯免疫法。

1.4.2 組織檢測 從液氮中取出結腸組織，按照10%（10 mg組織加入100μL生理鹽水）勻漿，以3 500 r/min、4℃離心取上清，采用酶聯免疫法檢測iNOS、HO-1、CSE等的量。

1.5 統計學處理 采用SPSS 13.0統計軟件使用秩和檢驗處理數據。數據均用表示。檢驗水準α=0.05，P＜0.05差異有統計學意義。

表1 各組小鼠血清NO、CO、H2S含有量的比較（）

表1 各組小鼠血清NO、CO、H2S含有量的比較（）

注：與空白組比較，★P＜0.05；各治療組與模型組比較，☆P＜0.05；各劑量優化劑之間比較，▲P＜0.05；傳統組與優化劑組比較，△P＜0.05；柳氮磺吡啶組與優化劑組、傳統組比較，●P＜0.05

組別 動物數 NO/（μmol·L-1） CO/（μmol·L-1） H2S/（pg·mL-1）2.03±0.75 0.71±0.25 5.00±0.83模型組 8 10.14±1.70★ 1.34±0.63★ 34.17±6.54★優化劑低劑量組 8 8.42±0.80☆ 1.01±0.50 23.93±6.40☆優化劑中劑量組 8 7.68±0.83☆ 0.77±0.28☆▲△● 17.45±2.95☆優化劑高劑量組 8 6.99±0.34☆▲ 1.36±0.47 10.36±1.29☆▲△尼如哈傳統劑組 8 8.14±1.58☆ 1.18±0.41 18.04±7.30☆柳氮磺吡啶組 8 6.08±2.15☆ 0.77±0.44 7.85±4.34空白組8☆●

2 結果

2.1 優化劑對CAC小鼠血清NO、CO、H2S及小鼠結腸組織iNOS、HO-1、CSE的影響 見表1、2。

2.1.1 模型組與空白組相比較，模型組的H2S、CSE、CO、NO、iNOS、HO-1含有量高于空白組（P＜0.05）。說明在CAC病變中H2S、CSE、CO、NO、iNOS、HO-1表達顯著增加。

2.1.2 各治療組與模型組比較，模型組H2S、CSE、NO、 iNOS、HO-1的量高于各治療組 （P＜0.05），說明各治療組對H2S、CSE、NO、iNOS、HO-1的量表達均有明顯作用。模型組CO的量高于中劑量組 （P＜0.05），說明只有中劑量優化劑組具有下調CO含有量的作用。

2.1.3 不同劑量優化劑組間多重比較，中劑量組對CO的作用最為顯著 （P＜0.05），說明高劑量作用顯著；高劑量組對 H2S、CSE、NO、iNOS、HO-1的影響最為顯著（P＜0.05）。

表2 各組小鼠腸組織iNOS、HO-1、CSE含有量的比較

2.1.4 優化劑與傳統組比較，中劑量組對CO調控的作用優于傳統組 （P＜0.05）；高劑量組對HO-1的調控作用優于傳統組 （P＜0.05）；高劑量組對H2S的調控作用優于傳統組 （P＜0.05），說明優化劑作用優于傳統劑。

2.1.5 各組與柳氮磺吡啶組相比，高劑量組對HO-1的作用高于柳氮磺吡啶組 （P＜0.05）；中劑量組對CO的作用高于柳氮磺吡啶組 （P＜0.05），說明優化劑較柳氮磺吡啶作用顯著。

3 討論

20世紀80年代中期，被發現的內源性氣體分子NO代表一種新型的非受體依賴性信號傳導機制，開創了新的研究領域 “氣體信號分子”，繼NO之后，CO和H2S也被發現［10］。它們具有分子量小、持續產生、彌散迅速及作用廣泛等特點，并能自由通過各種生物膜，相互作用，發揮生物學效應［11］，在許多的研究中已被證實和炎性反應有著密切的關系，并且通過干預和調節NO、CO、H2S在炎癥反應中的表達，可以明顯減輕炎癥反應損傷［12］。研究表明慢性炎癥常繼發腫瘤，而腫瘤組織活檢樣本中也尚存炎癥細胞，證實炎癥反應參與腫瘤形成［13］。所以通過減輕炎癥反應可干預其癌變進展。

我們通過本實驗發現，CAC小鼠NO、iNOS、CO、HO-1、H2S及CSE的量顯著升高，符合上述指標在CAC病變中的量變化規律。而優化劑高劑量組對NO、iNOS、HO-1、H2S及CSE下調作用顯著，中劑量組對CO具有下調作用。說明優化劑可有效抑制CAC小鼠血清及結腸組織中的氣體信號分子的產生。降低NO的量，可降低腫瘤的發生風險，抑制iNOS的過分表達，可消除其在NO介導的促瘤作用。調控CO及HO-1，可發揮其抗炎、抗凋亡、抗增生作用，保護腸道。而降低H2S含有量，可干預潰瘍性結腸炎的發展或腸上皮細胞的惡性轉化。可以說，尼如哈優化劑是通過下調CAC小鼠NO、iNOS、CO、HO-1、H2S及CSE的量，進而起到了保護結腸黏膜，干預CAC病變發展的作用。

該實驗是通過實驗方法驗證蒙醫藥對CAC防治作用的初次嘗試，也是蒙醫理論之 “氣”與氣體信號分子相關性的粗淺探討，但還需更多、更深入系統的臨床及實驗研究的驗證。筆者認為，在闡明 “氣”與氣體信號分子內在聯系的基礎上，立足于蒙醫基礎理論，應用毒副作用相對較小的天然蒙藥，在防治CAC臨床中起到輔助作用，提高患者生活質量，具有實際意義。

［1］ 唐 凱，王建國.炎癥性腸病并發結直腸癌的相關研究動態［J］.全科醫學臨床與教育，2010，8（6）：647-650.

［2］ 王國品，徐肇敏.潰瘍性結腸炎相關性結直腸癌研究進展［J］.中華消化內鏡雜志，2011，18（3）：190-192.

［3］ 徐春曉，張 艷，朱益民.炎癥在結直腸癌發生中的作用機制［J］.第二軍醫大學學報，2013，34（1）：78-81.

［4］ 張洪海，要根東.一氧化氮與疾病發生機制研究進展［J］.醫學綜述，2001，7（12）：716-717.

［5］ 王 艷，丁 虹，肖庚富.一氧化氮介導的腫瘤治療研究進展［J］.癌癥，2008，（4）：476-479.

［6］ 朱曙光，鄭 勇，孔 維，等.誘導型血紅素氧合酶在腹瀉型腸易激綜合征患者中的表達［J］.石河子大學學報，2005，23（6）：711-714.

［7］ 陳 雯，謝曉華.新型氣體信號分子硫化氫的研究進展［J］.醫學綜述，2004，14（24）：3704-3709.

［8］ 蘇德巴彥爾，烏敦高娃.淺析蒙醫藥治療腫瘤病的方法［J］.亞太傳統醫藥，2011，7（12）：76-77.

［9］ Neufert C，Becker C，Neurath M F.An induciblemousemodel of colon carcinogenesis for the analysis of sporadic and inflammation-driven tumor progression［J］.Nat Protoc，2007，2（8）：1998-2004.

［10］ 金紅芳，杜軍保，唐朝樞.氣體信號分子在心血管疾病發病中的意義［J］.中國醫學科學院學報，2005.27（4）：518-524.

［11］ 谷萬里，史載祥.氣體信號分子與血瘀證研究的再深入［C］.//慶祝中國中醫研究院成立50周年首屆中醫藥發展國際論壇暨首屆中醫藥防治艾滋病國際研討會論文集，2005：892-896.

［12］ 趙華棟.辛伐他汀對脂多糖誘導小鼠巨噬細胞氣體信號分子表達及細胞凋亡的作用研究［D］石家莊：河北醫科大學，2013.

［13］ 吉登波，崔景榮.腫瘤的發生發展及治療與炎癥的關系［J］.中國新藥雜志，2010，19（17）：1551-1555.

R285.5

B

1001-1528（2015）12-2746-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.12.037

2014-07-14

內蒙古自治區科技計劃項目 （kjt11sf07）

布圖雅 （1973-），女 （蒙古族），博士，教授，碩士生導師，從事蒙醫腸療治療潰瘍性結腸炎、結腸炎相關性結腸癌的臨床與實驗研究。Tel：13354711577，E-mail：butuyatl@126.com