正交試驗優(yōu)選過塘蛇的水提工藝

李 兵， 陳建惠， 盧汝梅， 農(nóng)梅冬， 鐘 江

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西南寧530200；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西南寧530012）

正交試驗優(yōu)選過塘蛇的水提工藝

李 兵1， 陳建惠1， 盧汝梅1， 農(nóng)梅冬1， 鐘 江2*

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西南寧530200；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西南寧530012）

目的 優(yōu)化過塘蛇的水提工藝。方法 正交試驗法考察液料比、提取時間、提取次數(shù)對過塘蛇干膏率及沒食子酸含有量的影響。結(jié)果 優(yōu)選出的最佳提取工藝為液料比16∶1，提取時間60 min，提取3次。結(jié)論 該工藝穩(wěn)定可行，有效成分提取率較高，適合大規(guī)模生產(chǎn)需求，可為過塘蛇制劑生產(chǎn)提供參考。

過塘蛇；水提取；干膏率；沒食子酸；正交試驗

過塘蛇是柳葉菜科水龍屬植物水龍Jussiaea repens L.的全草［1］，在廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院被廣泛用于治療各種皰疹，具有較好的療效，而沒食子酸是過塘蛇中的主要活性成分之一，具有抗腫瘤［2-3］、抗炎［4］、心血管保護［5-6］等作用，在藥材或制劑中常用HPLC法加以測定，作為質(zhì)量控制指標(biāo)性成分［7-8］。目前，過塘蛇在民間主要以湯劑入藥，現(xiàn)代研究報道較少，其物質(zhì)基礎(chǔ)研究尚屬空白，在一定程度上制約了該植物的現(xiàn)代化開發(fā)利用，因此本實驗對過塘蛇提取工藝進行研究，為制備顆粒劑提供參考。查閱文獻發(fā)現(xiàn)，以水為提取溶劑，經(jīng)提取、濃縮、干燥、制粒而成的濃縮顆粒，具有體積小、藥性強、藥效高、起效快、容易儲存、方便服用和攜帶等優(yōu)點［9］。研究表明［10-12］，目前主要采用正交試驗法優(yōu)化中藥提取工藝，故本實驗為找到適合大規(guī)模生產(chǎn)的過塘蛇顆粒制備工藝，提高其穩(wěn)定性，保證療效，以干膏收率和沒食子酸含有量為指標(biāo)，采用正交試驗法考察過塘蛇的提取工藝，為其工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津LC-20A HPLC色譜儀，包括5C18-PAQ Cosmosil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm）（島津國際貿(mào)易上海有限公司）；BP211D電子分析天平 （德國賽多利斯公司）；Millipore Simplicity-185超純水器（美國密理博公司）；SK2200LHC超聲儀 （53 KHz，上海科導(dǎo)超聲儀有限公司）。

1.2 試藥 沒食子酸 （中國食品藥品檢定研究院，批號110831-201204）。過塘蛇購自玉林藥材市場，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)韋松基教授鑒定為柳葉菜科水龍屬植物水龍Jussiaea repens L.的全草。

2 方法與結(jié)果

前期本課題組已對過塘蛇含有量測定方法進行了考察［13］，而本實驗采用正交試驗法進一步優(yōu)選其水提工藝。

2.1 樣品溶液的制備 將過塘蛇藥材粉碎，過二號篩，精密稱取適量，將不同方法提取的過塘蛇提取液用0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2 干膏率的測定 精密吸取各提取液20 mL，置于已恒定質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，按 《中國藥典》2010年版一部附錄IXG干燥失重法測定，計算干膏率。

2.3 單因素試驗

2.3.1 提取時間的考察 精密稱取過塘蛇藥材 （過二號

篩）10 g，25倍量水回流提取，提取時間分別為20、40、60、80、100 min，測定沒食子酸含有量［13］，再按 “2.2”項下方法測定干膏率，結(jié)果見圖1、圖2。由圖可知，當(dāng)提取時間為60 min時，沒食子酸含有量及干膏率趨于平衡，綜合考慮，選擇40～80 min。

圖1 提取時間對沒食子酸含有量的影響

圖2 提取時間對干膏率的影響

2.3.2 加水量的考察 精密稱取過塘蛇藥材 （過二號篩）10 g，分別加8、12、16、20、24倍量水，回流提取60 min，測定干膏率和沒食子酸含有量，結(jié)果見圖3、圖4。由圖可知，當(dāng)液料比為12∶1時，干膏收率已趨于緩和，并且沒食子酸含有量隨溶劑量的增加變化不大。綜合考慮，選擇12～16倍量水。

圖3 加水量對沒食子酸含有量的影響

圖4 加水量對干膏率的影響

2.3.3 提取次數(shù)的考察 精密稱取過塘蛇藥材 （過二號篩）10 g，加16倍量水，提取60 min，回流提取5次，測定干膏率和沒食子酸含有量，結(jié)果見圖5、圖6。由圖可知，提取3次后，沒食子酸含有量幾乎可以忽略不計，干膏率也下降到5.23%。綜合考慮，選擇提取1～3次。

圖5 提取次數(shù)對沒食子酸含有量的影響

圖6 提取次數(shù)對干膏率的影響

2.4 過塘蛇水提工藝的優(yōu)選

2.4.1 因素水平安排 在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，考察提取時間 （A）、加水量 （B）、提取次數(shù) （C）這3個因素對沒食子酸含有量及浸膏得率的影響，按L9（34）正交表設(shè)計試驗，見表1。

表1 正交試驗設(shè)計因素水平表

2.4.2 正交結(jié)果 每個試驗條件平行3份，按 “2.2”項下方法測定過塘蛇的浸膏得率，再測定提取液中沒食子酸的含有量［13］，結(jié)果見表2～4。由表2可知，影響干膏率和沒食子酸含有量的因素均依次為C＞A＞B，即提取次數(shù)＞提取時間＞加水量。由表3可知，C因素對沒食子酸含有量有顯著性差異。綜合沒食子酸含有量、干膏得率、實際生產(chǎn)和節(jié)約能源方面考慮，同時考慮到溶劑為水，價格低廉，為保證提取更完全，因此工藝條件選擇為A2B2C3，即提取時間60 min，加水量16倍，提取次數(shù)3次。

2.4.3 驗證實驗 取過塘蛇藥材3份，根據(jù)篩選得到的提取工藝進行驗證，結(jié)果見表5。由表可知，沒食子酸的含有量和干膏率均高于正交試驗結(jié)果，說明該工藝可行。因此，最終優(yōu)化的水提工藝為A2B2C3。

3 討論

本課題組前期已對過塘蛇的化學(xué)成分和抗菌活性進行了研究［14］，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沒食子酸是過塘蛇的主要活性成分。本實驗采用單因素結(jié)合正交試驗法，以過塘蛇的干膏率及沒食子酸含有量為評價指標(biāo)，特征性強，較單一指標(biāo)更科學(xué)合理，而且優(yōu)化所得的條件穩(wěn)定可靠，可為進一步開發(fā)過塘蛇提供理論依據(jù)。

中藥提取主要是采用適當(dāng)溶劑和方法將其中有效成分或部位盡可能提取出來，并把不需要的成分盡量不提或少提取出來的過程，合理的提取工藝應(yīng)最大程度提取有效成

分。在預(yù)實驗中，通過比較不同提取溶劑 （甲醇、乙醇、水）、提取方法 （回流提取、超聲波提取、浸漬法），最終確定以水為提取溶劑進行回流提取，此時沒食子酸含有量較高。

表2 正交試驗結(jié)果（n=3）

表3 沒食子酸含有量方差分析

表4 干膏率方差分析

表5 驗證實驗結(jié)果

由方差表可知，提取次數(shù)對沒食子酸含有量有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.05），而對干膏率無顯著性差異。但由直觀表可知，提取次數(shù)也是影響干膏率的主要因素，而加水量和煎煮時間對干膏率及沒食子酸含有量無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.05），故本實驗可為進一步尋找適合大規(guī)模生產(chǎn)過塘蛇配方顆粒的制備工藝提供參考。同時，在今后的研究中將引入多指標(biāo)性成分，并對其進行含有量測試，這將能準(zhǔn)確客觀地反映出顆粒劑提取工藝中有效成分的含有量。

［1］ 廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生局.廣西本草選編：上冊［M］.南寧：廣西人民出版社，1974：2721.

［2］ 雷 濤，趙玉佳，丁坤敏，等.核桃楸皮抗腫瘤化學(xué)成分研究概述［J］.中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2010，7（23）：9-11.

［3］ 李沐涵，殷美琦，馮靖涵，等.沒食子酸抗腫瘤作用研究進展［J］.中醫(yī)藥信息，2011，28（1）：109-111.

［4］ 高 雅，李 驊，王四旺，等.沒食子酸的藥理作用及其藥物代謝動力學(xué)研究進展［J］.西北藥學(xué)雜志，2014，29（4）：435-438.

［5］ 張浩楠，楊玉梅，鄔國棟，等.蒙藥廣棗抗心律失常作用有效成分的分離［J］.包頭醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2013，29（3）：1-4.

［6］ 卜麗梅，關(guān)鳳英，喬 萍，等.沒食子酸對大鼠缺血再灌注損傷后細胞凋亡的保護作用及機制研究［J］.中國實驗診斷學(xué)，2011，4（11）：1693-1697.

［7］ 楊瀚春，王 榮，何家田，等.一測多評法測定鎖陽中3種有效成分［J］.醫(yī)藥導(dǎo)報，2014，33（7）：952-955.

［8］ 顏冬蘭，張妮瑜，朱 麗，等.裸花紫珠中鞣質(zhì)的含量測定［J］.中醫(yī)藥導(dǎo)報，2014，20（5）：80-81.

［9］ 劉虓嶺.中藥顆粒劑臨床應(yīng)用體會［J］.中醫(yī)藥導(dǎo)報，2014，20（5）：134-136.

［10］ 王 瑩，王 青，張偉東，等.多指標(biāo)正交試驗法優(yōu)選決明子蒽醌類成分的提取方法［J］.中成藥，2012，34（9）：1684-1688.

［11］ 楊振亞，盧丹逸，馬志國.正交試驗法優(yōu)選沙蓯蓉提取工藝［J］.中成藥，2014，36（1）：177-179.

［12］ 何志超，李劍芳，李國成，等.正交試驗結(jié)合抗菌活性實驗優(yōu)選野菊花的提取工藝［J］.中成藥，2015，37（2）：302-306.

［13］ 李 兵，陳建惠，盧汝梅，等.過塘蛇藥材中沒食子酸含量分析［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，54（14）：3508-3509.

［14］ 盧汝梅，譚新武，廖彭瑩，等.水龍化學(xué)成分的研究［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2010，16（14）：99-101.

R284.2

B

1001-1528（2015）12-2758-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.12.041

2015-03-30

2013年國家科技支撐計劃課題 （2013BAI11B06）；2013年廣西科技廳重大專項課題 （桂科重1355001-4-1）

李 兵 （1982—），男，碩士，講師，從事中藥化學(xué)成分及質(zhì)量控制研究。Tel：15994348543，E-mail：gxlb0910@163.com

*通信作者：鐘 江 （1964—），女，碩士，主任醫(yī)師，從事中醫(yī)及壯醫(yī)防治皮膚病的研究。Tel：13877137788，E-mail：412170126@ qq.com