七葉蓮總三萜的提取工藝及其含量測定

何定峰， 洪佳妮， 徐先祥， 秦 思

（1.福建省泉州市中醫院，福建泉州362000；2.華僑大學生物醫學院，福建泉州362021）

七葉蓮總三萜的提取工藝及其含量測定

何定峰1， 洪佳妮1， 徐先祥2*， 秦 思2

（1.福建省泉州市中醫院，福建泉州362000；2.華僑大學生物醫學院，福建泉州362021）

目的 考察比色法測定七葉蓮中總三萜含有量的顯色條件，并對其提取工藝進行優化。方法 以齊墩果酸為對照品，對顯色條件進行考察，包括5%香草醛-冰醋酸用量、高氯酸用量、水浴溫度、反應時間，建立測定條件。再以總三萜含有量為指標，采用正交試驗法對提取工藝進行優化。結果 5%香草醛-冰醋酸溶液用量以0.3 mL為宜，高氯酸用量以1.2 mL為宜，水浴溫度以70℃為宜，反應時間以20 min為宜，并于顯色后30 min內進行測定。優選的提取工藝為以95%乙醇為溶劑，料液比1∶10，回流提取60 min，此工藝下總三萜的平均質量分數為22.58%。結論在優選的顯色條件下，該方法操作簡便快速、靈敏度高、結果穩定、重現性好，并且工藝穩定可行，可應用于七葉蓮總三萜成分的提取。

七葉蓮；總三萜；顯色條件；提取工藝；比色法；正交試驗

七葉蓮又名七葉藤、漢桃葉，為五加科植物七葉蓮Schefflera arboricola Hayata的干燥莖葉，主要分布于廣東、廣西、福建、臺灣等地，以根、莖、葉入藥［1］。其味苦、甘，性溫，有散瘀止痛，活血消腫之功效，臨床上主要用于風濕關節痛、三叉神經痛、坐骨神經痛、胃及十二指腸潰瘍疼痛等癥狀［2］。近年來，七葉蓮在化學成分、藥理作用方面有大量研究［3-6］，發現該植物除含有機酸、揮發油、蛻皮激素等成分外，主要為齊墩果烷型三萜及其苷類［2，7］。藥理研究表明，三萜類化合物具有廣泛的生理活性，如消炎抗菌、鎮痛、抗腫瘤、抗衰老、抗病毒、增加免疫力、保肝解毒等［8-9］。目前關于七葉蓮三萜類成分的研究很少，本實驗利用比色法測定七葉蓮總三萜的含有量，考察最適宜的顯色條件，并采用正交試驗設計對其提取工藝進行優化，旨在為該植物的進一步開發及應用提供研究基礎。

1 材料

Sartorius BSA124S型電子天平（賽多利斯科學儀器北京有限公司）；DJ-04型中藥粉碎機 （上海淀久中藥機械制造有限公司）；HH-1型電熱恒溫水浴鍋 （江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）；KQ 500E型超聲波清洗器 （昆山市超聲儀器有限公司）；RE 52-86A型旋轉蒸發儀 （上海亞榮生化儀器廠）；UV-2450型紫外-可見分光光度計 （日本島津公司）。

七葉蓮藥材 （福建省泉州中僑集團股份有限公司藥業公司），經本院湯少陵主管中藥師鑒定為七葉蓮S.arboricola Hayata的干燥莖葉。齊墩果酸對照品 （含有量測定用，批號201206，中國食品藥品檢定研究院）。香草醛、冰醋酸、高氯酸、95%乙醇、甲醇等均為分析純。

2 方法與結果

2.1 供試溶液的制備 取干燥至恒重的七葉蓮藥材，粉碎過篩，稱定20.00 g，置于1 000 mL圓底燒瓶中，加入15倍量75%乙醇，水浴加熱，回流提取60 min，提取液過濾，濾液減壓濃縮回收乙醇，干燥。再精密稱定提取物20 mg，置于25 mL量瓶中，加甲醇超聲溶解，稀釋至刻度，即得。

2.2 標準溶液的制備 精密稱取干燥至恒重的齊墩果酸對照品10.00 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，精密吸取1 mL至10 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得。

2.3 顯色工藝的考察

2.3.1 顯色波長的確定 參照文獻 ［10］，采用香草醛-冰醋酸-高氯酸法進行顯色。分別精密吸取標準溶液、供試溶液0.5 m L，置于具塞試管中，水浴揮干，依次加入新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL、高氯酸0.8 mL混勻，密塞，60℃水浴中加熱20 min，取出，冰水浴冷卻10 min，加冰醋酸5 mL，搖勻。然后，不加供試溶液而加顯色劑溶液，同法制得空白對照液，紫外-可見分光光度計進行全波長掃描，根據掃描結果，取最大吸收峰處波長541 nm作為檢測波長，見圖1。

2.3.2 5%香草醛-冰醋酸用量考察 精密吸取標準溶液0.5 mL 6份，水浴蒸干后分別加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，然后再分別加入高氯酸0.8 m L，置于60℃水浴中加熱15 min后取出，冰水浴冷卻10 m in，加入冰醋酸5.0 mL，搖勻，置于室溫下15 min后測定其吸光度，結果見圖2。根據結果，選定5%香草醛-冰醋酸溶液的最佳用量為0.3 mL。

圖1 香草醛-冰醋酸-高氯酸法顯色后的吸收光譜圖

圖2 5%香草醛-冰醋酸用量對顯色體系的影響

2.3.3 高氯酸用量考察 精密吸取標準溶液0.5 mL 6份，水浴蒸干后加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.3 mL，再加入高氯酸0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL，60℃水浴中加熱15 min后取出，冰水浴冷卻10 min，加入冰醋酸5.0 mL，搖勻，置于室溫下15 min后測定其吸光度，結果見圖3。根據結果，選定高氯酸的最佳用量為1.2 mL。

圖3 高氯酸用量對顯色體系的影響

2.3.4 水浴溫度的考察 精密吸取標準溶液0.5 mL 5份，水浴蒸干后加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.3 mL、高氯酸溶液1.2 mL，分別于40、50、60、70、80℃水浴加熱15 min。同時，做空白對照，測定不同水浴溫度下的吸光度值，并觀察各溫度下空白顏色是否發生變化，結果見圖4。由圖可知，吸光度隨溫度的升高而增加，但超過70℃時，空白液顏色開始發生變化，故確定最佳水浴溫度為70℃。

2.3.5 反應時間的考察 精密吸取標準溶液0.5 mL 5份，分別水浴10、15、20、25、30 min，然后測定其吸光度，結果見圖5。由圖可知，水浴加熱10～20 m in時，吸光度值急劇增加，20 min后緩慢遞增，但時間過長會導致空白液顏色發生變化，故選定最佳反應時間為20 min。

圖4 水浴溫度對顯色體系的影響

圖5 反應時間對顯色體系的影響

2.4 方法學考察與總三萜測定

2.4.1 線性關系考察 分別精密吸取標準溶液0.10、0.30、0.50、0.70、0.90 mL，置于具塞試管中，水浴蒸干，再依次加入新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.3 mL、高氯酸1.2 mL混勻，密塞，70℃水浴中加熱20 min，取出冷卻至室溫后，加冰醋酸5 mL定容至刻度，搖勻。再以顯色劑為空白，于541 nm處測定吸光度值 （A）。以A為縱坐標，標準溶液濃度為橫坐標 （C）繪制標準曲線，得回歸方程A=41.795C-0.013 1（r=0.999 1），線性范圍為1.54～13.85 mg/L，表明線性關系良好。

2.4.2 精密度試驗 精密吸取標準溶液6份，每份0.5 mL，進樣分析，得RSD為0.60%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復性試驗精密稱取同一批樣品6份，按 “2.1”項下方法制備供試品溶液，得RSD為1.55%，表明該方法重復性良好。

2.4.4 穩定性試驗 精密吸取同一供試溶液0.5 mL，分別于顯色后0、15、30、45、60、90 min測定吸光度，得30 min內的RSD為1.26%，而30 min后穩定性開始下降。因此，該溶液在30 min內穩定性良好，即應在顯色后30 min內進行測定。

2.4.5 加樣回收試驗 精確稱取含有量已知的供試溶液6份，每份0.3 mL，分別精密加入標準溶液0.2 mL，進樣分析，計算平均加樣回收率，結果見表1。

2.5 總三萜提取方法的考察

2.5.1 提取步驟 精密稱取七葉蓮粉末9份，每份20.00 g，分別置于圓底燒瓶中，加入相應濃度和體積的乙醇，水浴加熱，按相應時間進行回流提取，提取液過濾，濾液減壓濃縮回收乙醇，干燥。再精密稱定提取物20 mg，置于25 mL量瓶中，加甲醇超聲溶解，稀釋至刻度，即得供試溶液。

表1 加樣回收試驗結果（n=6）

2.5.2 因素水平和方差分析 根據前期單因素試驗考察情況，選取乙醇體積分數、料液比、提取時間這3個影響提取物總三萜含有量的主要因素，每個因素設3個水平 （表2），進行L9（33）正交試驗，見表3，方差分析結果表4。由表3可知，各因素影響順序依次為A＞C＞B，即乙醇體積分數對提取結果的影響最大，其次為提取時間、料液比。由表4可知，乙醇體積分數有顯著影響 （P＜0.05）。因此，結合實際生產考慮，最佳提取工藝參數組合為A3B1C2，即以95%乙醇為溶劑，料液比1∶10，回流提取60 min。

表2 因素水平

表3 正交試驗結果

表4 方差分析結果

2.5.3 驗證試驗 按優選的工藝提取3次，得到總三萜的質量分數分別為23.02%、22.32%、22.40%，平均質量分數為22.58%，RSD為1.69%，表明該優化工藝穩定可行。

3 討論

中藥總三萜類成分的的測定一般采用分光光度法［11］，常用的顯色體系有香草醛-冰醋酸-高氯酸、香草醛-冰醋酸-硫酸和香草醛-乙醇-硫酸［12-14］。經預實驗篩選，選用香草醛-冰醋酸-高氯酸作為比色法測定七葉蓮總三萜量的顯色劑，但顯色劑的用量、反應溫度及時間、反應后放置時間等因素對結果的影響較大，因此對顯色條件進行考察。結果發現，5%香草醛-冰醋酸溶液用量以0.3 mL為宜，高氯酸用量以1.2 mL為宜，水浴溫度以70℃為宜，反應時間以20 m in為宜，并于顯色后30 min內在541 nm波長下進行測定。該方法操作簡便快速、靈敏度高、測定結果穩定、重現性好但，測定時應注意控制反應溫度和時間。

以提取物總三萜得率為指標，經正交試驗優化的七葉蓮總三萜最佳提取工藝參數為以95%乙醇為溶劑，料液比1∶10，水浴回流提取60 min。經驗證，該提取工藝穩定可行，可作為七葉蓮總三萜成分的提取工藝。

七葉蓮總三萜含有量的測定方法及提取工藝尚未見報道，本實驗考察比色法測定的顯色條件，并以正交試驗對其提取工藝進行優化，這為該植物有效成分的進一步開發提供研究基礎。

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R284.2

B

1001-1528（2015）12-2761-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.12.042

2014-07-29

福建省科技計劃重點項目 （2012Y0049）；泉州市衛生局科研資助項目

何定峰（1965—），男，副主任藥師，研究方向為醫院藥學。E-mail：Dingfenghe@hotmail.com

*通信作者：徐先祥，男，副研究員，研究方向為中藥藥理學。E-mail：xuxianxiang@163.com