湖南產石菖蒲和水菖蒲揮發油成分分析和抑菌活性檢測

李 娟， 劉清茹， 肖 蘭， 謝 謙， 田小娟， 李順祥*

（1.湖南中醫藥大學，湖南省中藥活性物質篩選工程技術研究中心，湖南長沙410208；2.長沙衛生職業學院藥學系，湖南長沙410100）

湖南產石菖蒲和水菖蒲揮發油成分分析和抑菌活性檢測

李 娟1，2， 劉清茹1， 肖 蘭2， 謝 謙2， 田小娟2， 李順祥1*

（1.湖南中醫藥大學，湖南省中藥活性物質篩選工程技術研究中心，湖南長沙410208；2.長沙衛生職業學院藥學系，湖南長沙410100）

目的 研究湖南產石菖蒲和水菖蒲揮發油的成分組成和體外抑菌活性。方法 水蒸氣蒸餾法提取揮發油，GCMS法分析其成分組成，平皿打孔和數學級試管稀釋法測定其體外抑菌活性。結果 在石菖蒲揮發油中鑒定出41個化合物，主要為甲基胡椒酚 （45.06%）、順式異丁香酚甲醚 （35.51%）、β-細辛醚 （9.38%）和長葉松烯 （1.50%）；在水菖蒲揮發油中鑒定出46個化合物，主要為β-細辛醚 （16.58%）、藍桉醇 （14.38%）、水菖蒲酮 （10.81%）、去羥基異菖蒲烯二醇 （9.33%）、9-柏烷酮 （8.07%）和喇叭烯氧化物 （6.99%）。兩者體外均對除綠膿桿菌外的7種供試菌表現出明顯的抑制作用，并且后者對金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和乙型溶血性鏈球菌的抑制作用強于前者。結論 湖南產石菖蒲和水菖蒲揮發油的成分和抑菌活性均有較大差異，在實際應用中應加以區分。

石菖蒲；水菖蒲；揮發油；抑菌活性；GC-MS

菖蒲為天南星科菖蒲屬植物，始載于 《神農本草經》，被列為上品，民間常用其防病祛疫［1］。在我國資源豐富，迄今已發現7個品種和2個變種，分別是水菖蒲、石菖蒲、長苞菖蒲、金錢蒲、茴香菖蒲、香葉菖蒲、寬葉菖蒲、細根菖蒲 （水菖蒲變種）及金邊菖蒲 （石菖蒲變種）［2］，歷代本草［3-4］主要以水菖蒲和石菖蒲為藥材來源。現代研究表明，兩者富含揮發油，具有多種生物活性，尤其是在抑菌作用方面［5-8］。湖南是石菖蒲和水菖蒲的主產地之一，但這兩種藥材中揮發油成分的差異較大［9-10］，本實驗采用水蒸氣蒸餾法提取揮發油，利用氣相色譜-質譜聯用 （GC-MS）技術分析其成分組成，并通過平皿打孔和數學級試管稀釋法測定其體外抑菌活性，為合理利用和開發湖南產菖蒲屬植物提供實驗依據。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料 GCMSQP2010 GC-MS聯用儀（日本島津公司）；SW-CJ-1B超凈工作臺 （蘇州凈化設備有限公司）；WAC-47全自動高壓滅菌鍋 （北京勤業永為科技有限公司）；303-0S型電熱恒溫培養箱 （上海康路儀器設備有限公司）。

普通營養瓊脂 （肉湯）培養基 （杭州微生物試劑有限公司）；無菌脫纖維羊血 （北京陸橋技術股份有限公司）；明膠十六烷三甲基溴化胺培養基 （上海源葉生物科技有限公司）。乙酸乙酯、無水硫酸鈉等均為分析純。

石菖蒲和水菖蒲于2012年11月采自湖南瀏陽大圍山，經湖南中醫藥大學劉塔斯教授鑒定為天南星科植物石菖蒲Acorus tatarinowii Schott和水菖蒲Acorus calamus L.。將這兩種藥材洗凈，除去泥砂，取根莖，陰干，備用。

金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸埃希菌ATCC25922、綠膿桿菌ATCC27853、表皮葡萄球菌ATCC1228、痢疾志賀氏桿菌ATCC25931、白假絲酵母菌ATCC10231和乙型溶血性鏈球菌ATCC32210均購自南京便診生物科技有限公司；幽門螺桿菌由中南大學湘雅醫院范學工教授贈送。

1.2 揮發油提取 將石菖蒲和水菖蒲藥材粉碎成粗粉，分別稱取200 g，置于2 000 mL圓底燒瓶中，加6倍量蒸餾水浸泡2 h，自冷凝管上端加水至充滿揮發油測定器的刻度部分，加熱至沸，保持微沸6 h，冷卻后收集揮發油，即得。石菖蒲揮發油為無色透明油狀物，收率1.8%；水菖蒲揮發油為淡黃色透明油狀物，收率2.1%，分別用無水硫酸鈉脫水，密封保存。

1.3 GC-MS分析條件［11］

1.3.1 氣相色譜條件 RTX-5MS彈性石英毛細管柱（0.25 mm×30 m，0.25μm）；采用柱程序升溫，初始溫度為60℃，以4℃/min的速率升至220℃，保持5 min，再以10℃/min的速率升至240℃；進樣口溫度250℃，載氣為氦氣（純度99.999%）；柱內載氣體積流量1.0 mL/min；柱前壓130.0 kPa；分流比30∶1；進樣量1μL。

1.3.2 質譜條件 EI離子源；電子能量70 eV；掃描范圍35～550 amu；離子源溫度200℃；接口溫度260℃；倍增器電壓1.0 kV。

1.4 體外抑菌實驗

1.4.1 供試品溶液制備 取石菖蒲和水菖蒲揮發油適量，加入DMSO，無菌水溶解，即得質量濃度為100 mg/mL的供試品溶液（DMSO終濃度為0.5%）。

1.4.2 培養基制備 普通營養瓊脂 （肉湯）培養基用于培養金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、表皮葡萄球菌和痢疾志賀氏桿菌；往里另加入8%脫纖維羊血用于培養乙型溶血性鏈球菌；Skirrow血瓊脂培養基用于培養幽門螺桿菌；明膠十六烷三甲基溴化胺培養基用于培養綠膿桿菌；沙堡氏培養基用于培養白假絲酵母菌。

1.4.3 抑菌活性測定 采用改良打孔法［12］，分別定量移取供試液50μL，DMSO溶液為陰性對照，每個樣品重復6次。細菌在37℃培養箱中培養24 h（幽門螺桿菌用37℃微需氧環境 ［85%N2、10%CO2、5%O2］中培養72 h），真菌在28℃下培養48 h后，測量抑菌圈兩個垂直方向的直徑，以評價不同樣品的抑菌活性。然后，采用數學級試管稀釋法測定揮發油的MIC，每管液體培養基中分別加入不同濃度的揮發油，使其終濃度分別為0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2和0.1 mg/mL，各管最終總容量為1 m L。另設加等量不含任何藥物的M-H液體培養基作為正常對照，含菌不含藥的M-H液體培養基作為陽性對照。各實驗管中分別加入濃度為2×107cfu/mL的各菌株對數生長期新鮮培養物0.1 mL，同法培養后，以培養基中沒有細菌生長的最高稀釋度為MIC，確定抑菌濃度范圍。

2 實驗結果

2.1 揮發油成分分析 按上述實驗條件對石菖蒲和水菖蒲揮發油進行GC-MS分析，樣品總離子流圖見圖1和圖2，再采用面積歸一化法測定各成分的相對含有量，各色譜峰相應的質譜圖經計算機檢索及人工解析質譜，并與標準譜圖［13-14］比對。結果，從石菖蒲揮發油中分離得到51個色譜峰，鑒定出41個化合物，占揮發油總量的99.50%，主要為甲基胡椒酚 （45.06%）、順式異丁香酚甲醚（35.51%）、β-細辛醚 （9.38%）、長葉松烯 （1.50%）等；從水菖蒲揮發油中分離得到71個色譜峰，鑒定出46個化合物，占揮發油總量的93.98%，主要為β-細辛醚（16.58%）、藍桉醇 （14.38%）、水菖蒲酮 （10.81%）、去羥基異菖蒲烯二醇 （9.33%）、9-柏烷酮 （8.07%）、喇叭烯氧化物 （6.99%）、1-異丙基-4，8-二甲基螺 ［4.5］癸-8-烯-7-酮 （4.58%）等，詳見表1。

圖1 石菖蒲揮發油總離子流圖

圖2 水菖蒲揮發油總離子流圖

表1 湖南菖蒲屬植物揮發油的成分分析

續表1

續表1

2.2 揮發油抑菌活性 石菖蒲和水菖蒲揮發油對上述8種供試菌的抑菌圈直徑存在很大差異，抑菌活性結果見表2，MIC值見表3。

表2 石菖蒲和水菖蒲揮發油的抑菌活性比較 （抑菌圈直徑，n=6）

表3 石菖蒲和水菖蒲揮發油抑菌的M IC值

由表2可知，石菖蒲和水菖蒲揮發油均對除綠膿桿菌外的7種供試菌株表現出明顯的抑菌活性，但抑菌能力和范圍存在差異。兩者對革蘭陽性菌金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和乙型溶血性鏈球菌的抑菌作用均明顯強于革蘭

陰性菌大腸埃希菌和痢疾桿菌，對幽門螺桿菌和白假絲酵母菌也均有較強的抑制作用，但對大腸埃希菌和痢疾志賀氏桿菌的抑菌活性均較弱。其中，后者對金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和乙型溶血性鏈球菌的抑菌作用明顯強于前者 （P＜0.05）。

由表3可知，石菖蒲和水菖蒲揮發油對這7種供試菌株的MIC在0.3～0.8 mg/mL之間。其中，兩者對大腸埃希菌、痢疾志賀氏桿菌、白假絲酵母菌和幽門螺桿菌的MIC均分別為0.80、0.80、0.50和0.40 mg/m L，并且后者對金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和乙型溶血性鏈球菌（MIC分別為0.40、0.30和0.30 mg/mL）的抑制作用強于前者（MIC分別為0.50、0.40和0.40 mg/mL）。

3 討論

在植物形態方面，石菖蒲葉自根莖叢生，無中脈，而水菖蒲植物體較大，根莖比石菖蒲粗，葉有明顯的中脈；在藥材性狀方面，石菖蒲粗節似蜈蚣，扁曲分枝色灰棕，氣香油點環鮮明，而水菖蒲根莖粗壯少分枝，斷面海綿筋脈點，濃烈異香帶泥腥［15-16］；在化學成分方面，比較表1中石菖蒲和水菖蒲揮發油成分的組成，發現兩者差異較大；在抑菌活性方面，雖然兩者對金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌、幽門螺桿菌、白假絲酵母菌、大腸埃希菌和痢疾桿菌均表現出抑菌活性，但后者對金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和乙型溶血性鏈球菌的抑菌作用強于前者。綜上所述，石菖蒲和水菖蒲在植物形態、藥材性狀、化學成分和抑菌活性等方面均有明顯不同，因此，在實際應用中應加以區分。

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R284.1

B

1001-1528（2015）12-2778-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.12.048

2015-02-25

湖南省中醫藥科研計劃項目 （201577）；湖南省教育廳項目 （15C0114）；國家中醫藥管理局 “藥用植物學”重點學科課題（國中醫藥發 ［2009］30號）；湖南省高校科技創新團隊資助項目 （湘教通 ［2010］212號）

李 娟（1979—），女，助理研究員，研究方向為中藥物質基礎與作用機制。E-mail：forever_lijuan@163.com

*通信作者：李順祥 （1964—），男，教授，研究方向為中藥有效成分與資源研究。E-mail：455792859@qq.com