糖尿病大鼠模型的建立及相關蛋白組學的實驗研究

陳紅謹，劉小溪，連 捷，楊宇峰，石 巖

（1.山西中醫學院，山西太原 030024； 2.遼寧中醫藥大學附屬醫院，遼寧沈陽110032；3.大連市骨科醫院，遼寧 大連116011； 4.遼寧中醫藥大學，遼寧沈陽 110847）

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是一組以慢性血糖水平增高為特征的代謝性疾病，是由于胰島素分泌和（或）作用缺陷所引起。糖尿病是由遺傳和環境因素相互作用，導致胰島素絕對或相對分泌不足以及靶組織細胞對胰島素敏感性降低，引起蛋白質、脂肪、水和電解質等一系列代謝紊亂綜合征，主要以高血糖為標志。蛋白質組學（proteomics）是指以基因組編碼的所有蛋白質為研究對象，從細胞水平及整體水平上研究蛋白質的組成及其變化規律，從而深入認識有機體的各種生理和病理［1-2］。因此，對蛋白質的研究能為深入研究疾病的本質提供更多的生命信息，并篩選出疾病的生物標志物。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物與飼料 清潔級Wistar雄性大鼠40只，體重（220±20）g，由遼寧長生生物技術有限公司提供。普通飼料：購置于沈陽市于洪區前民動物實驗飼料廠。高脂飼料成分：玉米油（8%）、砂糖（6%）、蛋黃粉（5%）、膽固醇（1.5%）、豬膽鹽（0.2%）、甲基硫氧嘧啶（20 g）、谷氨酸鈉（味素）（1%）、基礎飼料（78.3%）。基礎飼料由沈陽市于洪區前民動物實驗飼料廠提供并負責加工。

1.1.2 儀器與試藥 超速低溫離心機（Beckman公司），高效液相色譜儀（型號：RIGOL 3220，北京普源精電科技有限公司），液質聯用質譜儀：四級桿-靜電場軌道阱質譜儀（型號：Q-Exactive，賽默飛世爾科技有限公司），串級質譜數據分析使用Protein Pilot 3.0軟件（ABI公司）。

膽固醇（分析純AR）及豬膽鹽：國藥集團化學試劑有限公司，檸檬酸、檸檬酸鈉（國藥集團化學試劑有限公司），鏈脲佐菌素（STZ）（美國Sigma公司）。

1.1.3 試劑溶液的配制 檸檬酸2.1 g，檸檬酸鈉2.94 g，分別用0.9%氯化鈉注射液定容至100 mL，使其各自的濃度為0.1 mol/L，取上述檸檬酸溶液28 mL，檸檬酸鈉溶液22 mL（亦可保持此比例多配點），充分混勻，4℃冰箱保存備用。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組與造模 適應性喂養1 w后按體重隨機分成正常組和模型組，每組10只。模型組予高糖高脂飼料喂養，自由飲水；禁食12 h，將鏈脲佐菌素（STZ）臨用時溶于“1.1.3項下”配制的溶液，采取少量多次腹腔注射的方法，首次注射劑量為30 mg/kg，以后每周每次注射劑量為10 mg/kg。喂養期間每2 w測1次血糖（取尾部靜脈血），當血糖≥16.7 mmol/L作為糖尿病大鼠造模成功。造模結束后有12只大鼠血糖≥16.7 mmol/L，死亡0只，造模的成功率為80%，造模時間為10 w。

1.2.2 檢測指標與方法

1.2.2.1 標本采集 造模成功后，正常組及模型組各取大鼠8只，標本采集前禁食12 h，10%水合氯醛（350 mg/kg）腹腔注射麻醉；腹正中開口，經腹主動脈穿刺采血，每個樣本都分兩部分，一部分用于檢測血糖，一部分靜置后，3 000 r/min離心10 min，取上清液于小離心管中，即刻放置于干冰中，寄往北京蛋白質組學研究中心進行蛋白質組學檢測分析。

1.2.2.2 iTRAQ標記 去高豐度蛋白：將每個血清樣本取等體積原液，各組混合后用去高豐度試劑盒去除高豐度蛋白，溶解，定量。樣本中加入dissolution buffer，溶解蛋白并bradford定量。酶切標記：將樣本分別取100 μg進行酶切標記，模型組樣本用116標記，空白對照組樣本用117標記，標記后樣本合并。

1.2.2.3 肽段分離 色譜柱：C18反相柱（Agela，C18色譜柱，250 mm×4.6 mm，填料顆粒直徑 5 μm）。流動相：A：2%ACN-98%H2O（氨水調 pH=10.0）；流動相B：98%ACN-2%H2O（氨水調pH=10.0）；溶劑梯度：5%～8%B，1 min；8%～32%B，24 min；32%～95%B，2 min；95%A，4 min；95%～5%B，1 min；柱溫 45 ℃；流速0.7 mL/min；檢測波長214 nm。

組分收集：1管/min，在8%～32%有效梯度內，共24組分。分為24個餾分，真空干燥。

1.2.2.4 質譜分析 將24個餾分用A液復溶后合并為8個樣本，上液質聯用質譜儀（Q-Exactive）。LC-MS質譜上樣：QE參數設置取抽干的樣本，溶解于 A 液（1.9%ACN：98%H2O：0.1%FA），12 000 r/min離心3 min，取上清，采EASY-nLC-1000液相與ThermoFisher的Q Exactive質譜儀檢測。

1.2.2.5 搜庫與分析 采用Proteome Discoverer 1.2軟件進行搜庫，搜索引擎為內置的mascot，數據庫為Rattus庫，并進行分析。

2 結 果

2.1 造模前的基線情況

結果見表1。

表1 造模前的基線情況 （s）

表1 造模前的基線情況 （s）

n組別 空腹血糖（mmol/L）體重（g）正常組 10 4.90±0.64 218.8±19.2模型組 15 5.12±0.48 220.5±16.8

由表1可見，模型組與正常組在實驗開始時血糖、體重方面比較差異均無統計學意義（P＞0.05），基線水平齊。

2.2 造模期間血糖的變化

結果見表2。

表2 造模期間血糖的變化 （mmol/L，s）

表2 造模期間血糖的變化 （mmol/L，s）

注：與正常組相應時間段比較，1）P＜0.05，2）P＜0.01

組別 第2周 第4周 第6周 第8周 第10周正常組 5.11±0.49 5.08±0.50 4.70±0.56 4.87±0.54 5.09±0.38模型組 6.13±0.771） 8.64±0.522） 12.49±1.072） 15.72±1.362） 21.32±3.412）

由表2可以看出，第2周開始，模型組血糖相應時間段較正常組顯著升高（P＜0.05）；第10周時，模型組大鼠的血糖基本達到了糖尿病模型的標準，即血糖值≥16.7 mmol/L。

根據糖尿病大鼠模型評估標準，1只大鼠血糖水平未達到標準，另外2只大鼠血糖值為過高。為了減少不利因素對實驗的影響，使實驗結果更能反映客觀情況，將這3只大鼠予以剔除，其余大鼠均符合成模標準，成模大鼠共12只，成模率為80%。

2.3 蛋白組學的變化

差異有統計學意義的蛋白見表3、表4，部分差異蛋白的質譜圖見圖1。

表3 上調大于1.5倍的蛋白

圖1 16758942蛋白的一級質譜、一級序列匹配、二級質譜、定量及標記圖

圖1為16758942蛋白的Intensity[counts]（106）一級質譜、一級序列匹配、二級質譜、定量及標記圖。

由表3、表4可見，與正常組比較（D-E），上調大于1.5倍的蛋白有17個，下調小于0.75倍的有50個。上調的蛋白中主要有MHCⅡ反式激活因子、主要尿蛋白、LIM結構域蛋白、谷胱甘肽S-轉移酶，下調的蛋白中主要有肉堿乙酰轉移酶、多聚免疫球蛋白受體前體等。

3 討論

糖尿病是目前繼腫瘤、心腦血管疾病之后的第三位威脅人類健康的重大非傳染性疾病，根據國際糖尿病聯盟（IDF）估計糖尿病的患病人數將從2007年的2.4億增加至2025年的3.8億［3］。隨著我國經濟發展、生活水平的提高以及人口的老齡化，糖尿病的患病率逐年增長。糖尿病已經成為一個嚴重的公共健康問題，因此，對糖尿病的研究具有重要的學術和臨床意義。

傳統的糖尿病大鼠模型建立方法，一般都是采用一次性大劑量注射鏈脲佐菌素（STZ>60 mg/kg）誘導急性糖尿病的發生，這樣會導致大鼠死亡率高，而且，大劑量的STZ短時間內迅速破壞B細胞，這與發生在自身免疫性胰島素炎基礎上的糖尿病在病程及發病機制方面存在較大差異，即免疫系統的變化因素參與糖尿病發生的機制不能被所建立的模型得以復制。本研究者認為，采用小劑量、多次注射STZ的方法，可以使B細胞逐漸少量地被破壞，這與糖尿病發生的機制及病程更接近，研究結果更能反映疾病的本質。

表4 下調小于0.75倍的蛋白

目前，國內關于從血清蛋白組學的角度研究糖尿病的發生發展的病理生理及其生物學機理的文獻比較少。本研究運用蛋白組學技術研究糖尿病大鼠模型，共獲得67個有統計學意義的差異蛋白。其中，MHCⅡ類分子反式激活蛋白（CⅡTA，classⅡtransactivator）是近些年來國際免疫學研究的熱點之一，對CⅡTA作用機制取得了重大突破。CⅡTA及其突變體在免疫調節和免疫治療中具有作用。CⅡTA是決定MHCⅡ類基因表達的關鍵成分，CⅡTA在MHCⅡ類分子的活化過程中所起的作用，有人將CⅡTA稱為MHCⅡ類分子表達的“ 限速因子（limiting factor）”［4］。在 IFN-γ 誘導 MHC Ⅱ類分子表達的過程當中，IFN-γ先誘導CⅡTA表達，進而由CⅡTA激活MHCⅡ類分子基因。在MHCⅡ類分子陰性的細胞中轉染入CⅡTA，能使之表達MHCⅡ類分子。有研究發現，CⅡTA并不直接結合DNA，而是通過作用于幾種與之相結合的反式作用蛋白，進而調控MHCⅡ類基因的轉錄。此外，CⅡTA在T細胞分化中也起著一定作用。MUPs蛋白中的一個亞型—MUP-1與糖脂代謝調節關系密切。2007 年，Tilton R G 等［5］對糖尿病小鼠的腎皮質進行蛋白組學分析，并發現MUP-1、MUP-2、MUP-6、MUP-11在糖尿病腎皮質中表達均有顯著差異。以MUP-1為代表的MUPs不僅與高血糖和胰島素水平相關，還與胰島素抵抗密切相關，MUPs的異常表達和分泌有可能參與了糖尿病動物模型的病理生理過程，具體機制尚不清楚。本研究中發現的LIM蛋白是一族數目龐大、功能繁多的蛋白家族，主要參與細胞的轉錄、凋亡、分化以及細胞骨架的組成等。目前LIM蛋白主要分為4類：LIM同源異型結構域蛋白（LHX）、單純 LIM 結構域蛋白（LMO）、LIM 激酶以及其他LIM蛋白。其中LIM激酶1（LIMK1）也是目前唯一可使cofilin發生磷酸化的激酶。Cofilin是肌動蛋白絲的特異性解聚因子，在LIMK1作用下磷酸化和失活，從而導致肌動蛋白細胞骨架的改變。

本研究表明，糖尿病的發病機制除了胰島素分泌異常、糖脂代謝紊亂外，免疫系統也發生了一系列的顯著變化，該變化對糖尿病發生發展的生物學機理以及在臨床治療上有何重要的影響，目前該方面的研究信息比較少，有待進一步探討和研究。

［1］劉驍勇，王世立，韓金祥.蛋白質組學技術及其在胃腸道腫瘤標志物研究中的進展［J］.中華腫瘤防治雜志，2006，13（1）：69-73.

［2］朱文，周清華.蛋白質組學及其在肺癌中的研究進展［J］.中國肺癌雜志，2006，9（1）：89-92.

［3］International Diabetes Federation.Diabetes Atlas［M］.3 ed.Belgium：International Diabetes Federation，2006.

［4］Chang C H，Fontes J D，Peterlin M，et al.Class Ⅱ transactivator（CⅡTA）in sufficient for the inducible expression of major histocompatibility complex class Ⅱ genes［J］.J Exp Med，1994，180（4）：1 367-1 374.

［5］Tilton R G，Haidacher S J，Lejeune W S，et al.Diabetes-induced changes in the renal cortical proteome assessed with two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry［J］.Proteomics，2007，7（10）：1 729-1 742.