HPLC-DAD法分析栝樓桂枝湯血中移行成分

向 青 ，許 文 ，劉 杰 ，張俊賢 ，陳 琳 ，陳嫻雯 ，徐 偉 ，褚克丹

（1.福建中醫藥大學藥學院，福建 福州 350122；2.福建中醫藥大學生物醫藥研發中心，福建 福州 350122）

栝樓桂枝湯來源張仲景的《金匱要略》［1］，由天花粉、桂枝、白芍、甘草、生姜、大棗6味藥組成。臨床上主要用于腦卒中后肢體痙攣及康復治療［2-3］，并且藥理研究表明栝樓桂枝湯具有良好的神經保護作用［4-8］。本研究采用HPLC-DAD全波長掃描法，通過對比栝樓桂枝湯原始方、栝樓桂枝湯灌胃給藥大鼠后的含藥血清及空白血清三者全波長掃描信息，分析復方血中移行成分，為揭示栝樓桂枝湯抗腦卒中后肢體痙攣與神經保護藥效物質提供實驗依據。

1 儀器與試藥

日本島津LC-20A高效液相色譜儀（包括LC-20A泵、DGU-20A3脫氣機、SIL-20A自動進樣器、CTO-20A柱溫箱、M20A二極管陣列檢測器和LC solution工作站）；5417R型小型臺式高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；KQ2200B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；WH-1型微型渦旋混合儀（金壇市盛藍儀器制造有限公司）；微量移液器（德國Eppendorf公司）；CPA225D型十萬分之一分析天平（德國Sartorius公司）；乙腈、甲醇、甲酸（德國Merck公司）；Milli-Q超純水儀（美國Millipore公司）；其余試劑均為分析純。

栝樓桂枝湯顆粒（福建省第二人民醫院院內制劑）；沒食子酸（中國藥品生物制品檢定所，批號：110831-200302）；肉桂酸（中國藥品生物制品檢定所，批號：110786-200503）；甘草酸（中國藥品生物制品檢定所，批號：110731-200615）；芹糖甘草苷（上海TAUTO公司，批號：12110622）；五沒食子酰葡萄糖（上海TAUTO公司，批號：13102821）；芹糖異甘草苷（上海 TAUTO公司，批號：13061031）；芒柄花苷（上海 TAUTO公司，批號：13040722）；異甘草苷（上海 TAUTO 公司，批號：12111032）；甘草苷（成都曼思特生物科技有限公司，批號：MUST-120290）；甘草素（成都曼思特生物科技有限公司，批號：MUST-12022207）。以上標準品經面積歸一法測定，純度均大于98%。氧化芍藥苷、芍藥苷亞硫酸酯、苯甲酰芍藥苷、芍藥苷、芍藥內酯苷為自行分離純化，并經MS、NMR鑒定結構，HPLC-DAD檢測，面積歸一化法計算，純度均大于98.5%。

動物：SPF級雄性SD大鼠6只，體質量（250±20）g，福建中醫藥大學實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK（京）2012-0001。

2 方法與結果

2.1 灌胃液的制備方法 取栝樓桂枝顆粒100 g，加入10倍量50%乙醇，加熱回流提取2次，每次1 h，合并濾液減壓蒸餾至無醇味，制得0.9 g／ml的栝樓桂枝湯提取液。根據臨床用量換算成大鼠灌胃給藥劑量為 3.6 g／（kg／d）。

2.2 實驗動物及血清的采集方法 雄性SPF級SD 大鼠 6只，250 g左右，在溫度（23±2）℃、濕度（55±10）%的動物房內飼養，每天接受12 h的光照自由飲食。將大鼠隨機分成2組，每組3只，于給藥前12 h禁食，可自由飲水。給藥組按3.6 g／kg劑量連續灌胃3次，每次間隔1 h，給藥栝樓桂枝湯提取液。空白組灌胃用等體積的蒸餾水，同樣連續灌胃3次，每次間隔1 h。在腹主靜脈收集最后一次灌胃后 10 min的全血，3000 r／min離心 10 min，取上清即得血清。

2.3 血清樣本的前處理方法 合并給藥血清，取2 mL，加入 4 倍量的甲醇，渦旋 2 min，12000 r／min離心10 min，取上清液室溫下吹干，殘渣用200 μL 50%甲醇復溶，12000 r／min離心 10 min，取上清進樣10 μL進行HPLC-DAD分析。空白血清的處理同上。

2.4 色譜條件 色譜柱：Diamonsial C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）-0.1%甲酸水（B）；梯度洗脫程序：0～50 min 5%A～32%A，50～60 min 32%A～48%A；流速：0.8 ml／min；柱溫：30℃；進樣量：10 μL；DAD 全波長掃描范圍：190～400 nm；液相色譜檢測波長：254 nm。該色譜條件下所得栝樓桂枝湯原始復方圖，灌胃給藥血清圖，空白血清DAD全波長掃描HPLC疊加對比圖，如圖1所示。

圖1 HPLC-DAD各組色譜對比圖

2.5 成分分析 ① 通過HPLC色譜疊加圖對比，找出給藥血清中保留時間上與原始復方重疊的色譜峰，從色譜上找出原始復方和給藥血清24個共有峰，如圖1所示。② 對各個共有色譜峰進行DAD全波長掃描圖的提取，通過對比原始復方組、給藥血清組、空白血清組三者全波長的信息來確認可能的入血移行成分。如果原始復方色譜峰的DAD掃描圖和給藥血清的掃描圖特征一致，而相應保留時間處的空白血清沒有該特征，那么就指認該成分可能為入血成分。以色譜峰5為例，如圖2所示：原始復方和給藥血清DAD全波長掃描圖顯示231 nm處有最大吸收波長，而相應保留時間處的空白沒有該特征吸收，則認為該成分為入血移行成分；通過與標準品芍藥苷比對，該峰保留時間和DAD光譜掃描圖和標準品基本一致，故鑒定該入血成分為芍藥苷，其他成分采用類似指認鑒定方法。此外，如果原始復方色譜峰的DAD掃描圖和給藥血清的掃描圖特征一致情況下，而相應保留時間處的空白血清也顯示該紫外特征，那么暫時不能認為該成分為入血成分。以23號峰為例，如圖2所示：雖然該峰是原始復方和給藥血清的共有峰，但是原始復方組、給藥血清組、空白血清組三者DAD光譜特征均一致，該成分難以判定是否入血，可能是由于內源性物質不僅色譜上干擾，同時其光譜上也和原始方的成分存有類似結構。通過該方法共指認栝樓桂枝湯血中移行成分共22個（1～22號峰），采用標準品進一步比對鑒定其中16個。

圖2 各組色譜峰5和23的DAD全波長掃描對比圖

3 討 論

3.1 給藥方案考察 本研究前期比較了單次給藥與連續灌胃給藥對復方入血移行成分的影響，發現單次給藥后不同時間點取血所得峰響應低，峰容量小，而用連續灌胃給藥法（連續3次，每次間隔1 h）能顯著提高復方入血程度及峰容量，可能原因是復方成分多而復雜，不同成分結構、極性等不同導致吸收存在差異，并且多成分間可能存在吸收拮抗或者協同作用，導致復方成分群吸收不一致。如果給藥一次后某個時間點取血某些成分可能由于半衰期長還未吸收或者吸收弱導致未能檢測出。同時復方吸收入血后的成分群其代謝消除速率不同，對于某些消除速率快的化合物，如果取血時間太久，其可能在體內已消除消失而影響檢測。因此為了提高峰容量和峰響應，我們采用連續灌胃給藥法測定栝樓桂枝湯血中移行成分獲得滿意效果。

3.2 血漿樣品及色譜條件優化 本研究采用HPLC-DAD法研究復方血中移行成分，考慮復方血中移行成分濃度可能較低，為了能更好地分析血中移行成分，對比了不同分析取樣量。結果表明含藥血清取樣量為2 mL時各個色譜峰檢出良好，DAD全波長掃描光譜特征明顯。同時為了提高色譜分離度，減小內源性物質的干擾從而增強DAD掃描光譜的比較，我們對色譜條件進行了優化：通過比較不同廠家色譜柱對栝樓桂枝湯的分離效果，最終選擇色譜柱：Diamonsial C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）。流動相系統的選擇，先后試用了5種流動相系統：乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%甲酸水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-0.5%醋酸水，結果表明：使用乙腈體系流動相優于甲醇體系流動相，并且水相中加入0.1%甲酸有利于峰形的改善及色譜峰的分離，最終選擇乙腈-0.1%甲酸水作為流動相系統。提取波長的選擇：DAD全波長掃描，比較了 214、230、254、275、320、360 nm下原始復方組和給藥血清組的對比圖，發現254 nm下峰容量最多，并且囊括了其他色譜下的色譜重疊峰，最終采用254 nm作為疊加對比提取波長。

3.3 入血成分討論 栝樓桂枝湯由天花粉、桂枝、白芍、甘草、生姜、大棗6味藥組成，本研究結果表明入血成分有22種，其中鑒定的沒食子酸、氧化芍藥苷、芍藥苷亞硫酸酯、芍藥內酯苷、芍藥苷、五沒食子酰葡萄糖、苯甲酰芍藥苷來自白芍；芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖異甘草苷、異甘草苷、芒柄花苷、甘草素、異甘草素、甘草酸來自甘草；肉桂酸來自桂枝。這些成分可能是栝樓桂枝湯治療腦卒中后肢體痙攣與神經保護的體內藥效物質。

本研究采用HPLC-DAD全波長掃描法分析栝樓桂枝湯血中移行成分，指認了22個入血原型成分并經過標品比對鑒定了其中16個成分，提示它們可能對該復方發揮藥效貢獻較大。在后續研究中，為更好地闡明栝樓桂枝湯的體內藥效物質，我們將進一步考察這些入血成分的生物活性。

（致謝：本研究在福建省中藥產業技術開發基地、福建省中藥學重點實驗室平臺、康復技術協同創新中心、國家中醫藥管理局中醫康復研究中心資助下完成）

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