新過敏煎對新型變應性鼻炎大鼠模型免疫機制的實驗研究

李孝波，李 霞，程生輝，郝瑞春，李培碩，羅秀夏，門九章

（山西中醫學院，山西 太原 030024）

新過敏煎對新型變應性鼻炎大鼠模型免疫機制的實驗研究

李孝波，李 霞，程生輝，郝瑞春，李培碩，羅秀夏，門九章

（山西中醫學院，山西 太原 030024）

目的：觀察新過敏煎治療新型變應性鼻炎（AR）大鼠模型的作用機制。方法：將大鼠按照血pH值進行初篩分組，將血pH值小于中間值的48只大鼠配合特殊喂養與特殊行為干預后隨機分為5組：空白對照組、模型組、陽性對照組、麻芥沖劑組、新過敏煎組，每組12只。除空白對照組與模型組外，余組造模后分別給藥，療程14 d。觀察各組AR大鼠模型鼻炎癥狀積分以及病理組織形態學變化，檢測大鼠血清干擾素－γ（IFN－γ）、白介素－4（IL－4）水平變化。結果：與模型組比較，新過敏煎組、麻芥沖劑組與陽性對照組鼻炎癥狀積分明顯降低（P＜0.05），血清IFN－γ水平升高（P＜0.05），血清IL－4水平明顯降低（P＜0.05）；鼻黏膜充血與炎癥細胞浸潤改善。結論：新過敏煎與麻芥沖劑均可顯著改善變應性鼻炎模型大鼠鼻炎癥狀，改善病理組織損傷，具有良好的抗炎作用和抗過敏效果，推測其作用機制與調節血清IL－4與IFN－γ在體內的平衡有關。

變應性鼻炎；麻芥沖劑；免疫機制；實驗研究

新過敏煎為本課題組運用頻數分析和聚類分析，從文獻學角度對變應性鼻炎（AR）的中藥使用規律以及方證對應進行分析歸納，篩選高頻方藥后組合成的新型處方。本研究旨在通過相關實驗全面評價新過敏煎和麻芥沖劑的抗炎、抗過敏效果，并側重從免疫學角度探討其內在機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 選用昆明種大鼠96只，雌雄各半，清潔級，體重190～220 g，購自北京中國醫學科學院實驗動物中心，合格證號［京（動）001－005］。實驗過程中動物飼養于山西中醫學院實驗中心動物房，溫度21℃～26℃，相對濕度30%～40%。

1.1.2 試劑 卵白蛋白（OVA），美國Sigma公司分裝；氫氧化鋁（北京化工廠，批號：950321）；生理鹽水（石家莊四藥有限公司，批號：110316303）；大鼠干擾素－γ（IFN－γ）ELISA試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，批號：EK0406）；大鼠白介素－4（IL－4）ELISA試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，批號：EK0409）。

1.1.3 實驗藥物 鼻炎康片（由佛山德眾藥業有限公司生產，批號：0807380），0.37 g/片，每片含1 mg撲爾敏；新過敏煎與麻芥沖劑均由山西中醫學院中藥系提供，其中麻芥沖劑每10 g含生藥81 g。

1.1.4 儀器與設備 AT－858型自動酶標分析儀，上海安泰公司；Roche血氣分析儀；KDC－1004低速離心機，安徽科大創新股份有限公司中佳分公司生產；電熱恒溫水溫箱，上海醫用恒溫設備廠，批號：HHW21－420；電子天平，德國賽歐利斯；架盤藥物天平，北京醫用天平廠，批號：HC－TP11B－5；移液器，北京青云卓立精密設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型制備

1.2.1.1 動物預處理 將大鼠輕度麻醉后，固定，經靜脈抽血2 mL備用（從鎖骨上方，緊貼鎖骨中間的地方進針，進針后，稍稍抽下針管，如果沒有血，則往前或向后走下針頭）。采用Roche血氣分析儀測試，測定大鼠血pH值，結果為（7.286±0.211）。取血液pH值的中間值7.29，將大鼠均分為兩組，其中48只pH＜7.29歸入新模型組，余下48只pH＞7.29，空白對照組12只，舊模型組36只。其中新模型組配合特殊喂養（缺乏維生素的單一高蛋白、高脂肪、高糖喂養，具體比例為每公斤飼料中混合豬油200 g、雞蛋5枚、綿白糖200 g）與特殊行為干預方式（定制小鼠籠飼養以減少其活動空間；每隔1 h設定電子噪音鬧鈴予以驚擾，早中晚3次于鼠籠外放養家貓1次予以驚嚇），時間30 d。空白對照組與舊模型組常規喂養30 d。

1.2.1.2 基礎致敏與局部致敏 30 d后，除空白對照組外，余下大鼠均接受基礎致敏，將卵白蛋白0.3 mg，輔以氫氧化鋁30 mg作佐劑加生理鹽水1 mL形成混懸液，行腹腔注射，隔日1次，共7次。采用2%卵白蛋白生理鹽水，以移液器滴入大鼠雙側鼻腔，每側0.5 mL，每日1次，共7次。造模成功后，除空白對照組外每只大鼠仍隔日滴鼻1次，直至實驗結束。

1.2.2 分組給藥 新模型組48只大鼠隨機分為4組，即模型組、陽性對照組、新過敏煎組、麻芥沖劑組，每組12只。合原空白對照組12只，共計5組。造模完成后即進行灌胃給藥，每日1次，連續給藥14 d。空白對照組與模型組大鼠每日灌服蒸餾水。陽性對照組每只動物根據說明書折算用量，給予鼻炎康1.80 g/kg。新過敏煎組和麻芥沖劑組分別灌服不同濃度的新過敏煎9.14 g/kg、麻芥沖劑1.05 g/kg。

1.2.3 觀察指標

1.2.3.1 大鼠AR模型的行為學觀察與評價 自鼻腔激發開始后第1天、第4天、第7天，觀察大鼠搔鼻動作、噴嚏和流涕情況，記錄大鼠鼻腔激發癥狀，每次30 min，換算記分后判斷造模是否成功，比較新舊模型組的造模效率。總分＞5分判定為變應性鼻炎模型復制成功。于治療第1天、第7天、第14天分別觀察大鼠鼻腔激發癥狀，記分作為療效判定的依據。以上各項指標均采用疊加量化計分法，鼻癢、噴嚏和流涕的積分標準見表1。

表1 大鼠AR模型的行為學觀察和評分標準

1.2.3.2 血清IL－4、IFN－γ測定 于第14天末次給藥后1 h，以含2%卵白蛋白生理鹽水滴鼻后3 h，將大鼠麻醉，腹主靜脈取血，分離血清，按試劑盒說明書操作步驟檢測各指標。

1.2.3.3 病理組織學檢測 大鼠取血后立即將其斷頭處死，摘取鼻中隔黏膜，固定于20%甲醛中性緩沖液中，鼻中隔黏膜石蠟包埋，常規切片進行HE染色，光鏡下觀察鼻黏膜組織學改變。

1.3 統計學方法

實驗數據應用SPSS13.0軟件處理，進行方差分析，以均數±標準差（±s）表示，組間數據比較采用單因素方差分析。

2 結 果

2.1 新舊模型大鼠鼻炎癥狀積分的比較

與空白對照組比較，新舊模型組積分顯著升高（P＜0.05），且積分均大于5，提示造模成功。與舊模型組比較，新模型組積分更高，差異具有統計學意義（P＜0.05）。結果見表2。

表2 新舊模型大鼠鼻炎癥狀積分的比較 （分，±s）

表2 新舊模型大鼠鼻炎癥狀積分的比較 （分，±s）

注：與空白對照組比較，1）P＜0.05；與舊模型組比較，2）P＜0.05

組別 n 第1天 第4天 第7天空白對照組 12 0 0.37±0.52 0.52±0.48舊模型組 36 0 4.80±1.301） 6.10±1.401）新模型組 48 0 5.70±0.801）2） 7.30±1.651）2）

2.2 對AR大鼠模型鼻炎癥狀積分的影響

除空白對照組外，各組給藥前鼻炎癥狀總積分比較差異無統計學意義。與空白對照組比較，造模各組給藥前積分顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，新過敏煎組、麻芥沖劑組和陽性對照組在治療第7天、第14天鼻炎癥狀總積分均顯著降低（P＜0.05），但組間差異無統計學意義。結果見表3。

表3 對新型AR大鼠模型鼻炎癥狀積分的影響 （分，±s）

表3 對新型AR大鼠模型鼻炎癥狀積分的影響 （分，±s）

注：與空白對照組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05

組別 n 第1天 第7天 第14天空白對照組 12 0.52±0.48 1.3±0.4 1.3±0.6模型組 12 7.30±1.651） 6.7±0.81） 6.9±0.61）陽性對照組 12 7.20±0.801） 4.5±1.51）2） 0.9±0.71）2）麻芥沖劑組 12 7.10±1.901） 4.7±1.21）2） 1.2±0.81）2）新過敏煎組 12 7.30±1.301） 4.0±1.51）2） 0.6±0.51）2）

2.3 對AR大鼠血清IL－4、IFN－γ的影響

與空白對照組比較，模型組血清IFN－γ水平降低，IL－4水平升高（P＜0.05）。與模型組比較，新過敏煎組、麻芥沖劑組和陽性對照組血清IFN－γ水平均明顯升高，IL－4水平均降低（P＜0.05）。與陽性對照組、新過敏煎組比較，麻芥沖劑組血清IFN－γ水平顯著升高，IL－4水平降低（P＜0.05）。結果見表4。

表4 對AR大鼠血清IL－4、IFN－γ的影響 （±s）

表4 對AR大鼠血清IL－4、IFN－γ的影響 （±s）

注：與空白對照組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05；與麻芥沖劑組比較，3）P＜0.05

組別 n IL－4（pg/mL） IFN－γ（pg/mL）空白對照組 12 28.85±18.64 236.44±72.36模型組 12 82.42±16.781） 108.52±87.591）陽性對照組 12 32.79±15.412）3） 237.85±76.422）3）新過敏煎組 12 35.66±24.102）3） 274.79±63.672）3）麻芥沖劑組 12 25.73±11.122） 285.92±72.832）

2.4 鼻黏膜組織病理形態學的變化

病理組織檢查發現，空白對照組大鼠鼻黏膜上皮組織、黏膜下組織與腺體均正常，無炎細胞浸潤、充血、增生的病理改變；模型組大鼠鼻黏膜下層與腺體出現大量炎細胞浸潤與充血現象；陽性對照組大鼠鼻黏膜的上皮組織病理變化得到明顯改善，但黏膜下仍可見炎細胞浸潤與充血現象。麻芥沖劑組大鼠鼻黏膜下未見炎性細胞，鼻黏膜組織恢復正常。新過敏煎組大鼠鼻黏膜上皮細胞基本正常，但黏膜下仍可見少量炎細胞浸潤。結果見圖1。

3 討論

圖1 各組大鼠鼻黏膜組織病理形態學的變化

新過敏煎為課題組運用頻數分析和聚類分析，從文獻學角度對AR的中藥使用規律以及方證對應進行分析歸納，篩選高頻方藥后組合為新型處方。具體藥物有黃芪30 g，防風6 g，辛夷9 g，白術12 g，蒼耳子12 g，白芷12 g，甘草6 g。功效：益氣宣肺、祛風散邪。麻芥沖劑為課題組治療AR的臨床經驗方，該方針對變態反應性鼻炎多陽氣不足的體質特點而設定，具體藥物為麻黃6 g，白芥子9 g，黃芪30 g，防風6 g，當歸12 g，元參12 g，甘草6 g。功效：解表興陽、祛風解毒。

造模大鼠自局部致敏開始，鼻癢、噴嚏、流清涕的癥狀逐步加重，根據積分超過5分即表明造模成功，大鼠于滴鼻7d后造模全部成功。與舊模型組相比，新模型組積分更高，新模型組鼻炎癥狀表現更為典型和突出，表明采用血pH值篩選并配合特殊喂養、行為干預的新型造模方法可行。

經給藥后，與模型組比較，各治療組噴嚏、搔鼻、流涕癥狀均顯著減少，表明新過敏煎、麻芥沖劑、對照藥物鼻炎康均具有改善AR大鼠鼻炎常見癥狀的作用，且3組積分比較差異無統計學意義。

AR的病機復雜，但越來越多證據表明，T細胞系列中的Th細胞及其分泌的細胞因子失衡在AR的發病中起重要作用，其中Th2/Th1平衡及其分泌的細胞因子在機體免疫防御反應的調節中具有關鍵性作用［1－5］。本實驗結果表明新過敏煎與麻芥沖劑均可降低AR模型大鼠血清IL－4水平并升高IFN－γ水平，提示其作用機理的發揮與糾正Th2/Th1平衡有密切關系，應該是通過增強Th1細胞的活性以及對Th2細胞增殖的抑制作用從而達到抗AR的作用。

以上結果表明，新過敏煎與麻芥沖劑均可顯著改善AR模型大鼠的鼻炎癥狀，具有保護鼻黏膜上皮細胞和黏膜下組織及腺體的作用，以及良好的抗炎作用和抗過敏效果，推測其作用機理與調節血清IL－4與IFN－γ在體內的平衡有關。麻芥沖劑對于改善病理組織及降低AR模型大鼠血清IL－4水平并升高IFN－γ水平顯示出一定優勢，在AR的癥狀改善方面與新過敏煎相比差異無統計學意義，這與實驗預想略有出入。通過本研究有兩點啟示：第一，通過對中醫大樣本的經驗與用藥規律進行分析與總結是一條可行的思路；第二，仍需關注中醫獨特經驗的運用，比如對麻芥沖劑興陽法的運用等，留待今后進一步研究。

［1］李培碩，劉亞明.中藥治療過敏性鼻炎的Meta分析［J］.山西中醫學院學報，2010，11（3）：37-39.

［2］趙建東，王世振,馬鳳梅.Th1和Th2細胞及相關細胞因子在變應性鼻炎發病中的變化［J］.臨床耳鼻咽喉科雜志，2005，19（17）：794-796.

［3］聶玲娟，王東方.變應性鼻炎Th1/Th2細胞失衡及共相關細胞因子與IgE水平的相關性研究［J］.遼寧中醫藥大學學報，2011,13（3）：86-88.

［4］席斌,田道法.變應性鼻炎肺氣虛證與血清IL-4和IFN相關性的實驗研究［J］.中國中西醫結合耳鼻咽喉科雜志，2007,15（3）：166-170.

［5］阮巖，楊占軍，陳蔚，等.溫腎補陽法對腎陽虛變應性鼻炎大鼠模型血清Th1/Th2細胞因子表達的影響［J］.中藥新藥與臨床藥理，2006,17（1）：29-32.

（編輯：梁葆朱）

Experimental study of new Guominjian on immunologic mechanism of rat models with allergic rhinitis of new type

Li Xiaobo，Li Xia，Cheng Shenghui，Hao Ruichun，Li Peishuo，Luo Xiuxia，Men Jiuzhang
（Shanxi College of Traditional Chinese Medicine，Taiyuan Shanxi 030024）

Objective：To study the mechanism of new Guominjian on rat models with allergic rhinitis of new type.Methods：The rats were screened according to the blood pH value，and the partial animals，whose blood pH value was smaller than intermediate value，were specially fed and intervened.Then these rats were randomly divided into 5 groups with 12 rats each，including blank control group，model group，positive control group，Majie granule group and new Guominjian group. Except for blank control group and model group，the rest groups were administered with corresponding drugs lasting for 14 days，and then their effects on symptom scores of rhinitis and the change of histomorphology were observed.Furthermore，contents of interferon-γ and interleukin-4 in serum were also detected.Results：In new Guominjian group，Majie granule group and positive control group，the symptom scores of rhinitis were all decreased when compared to that in model group. Besides，the hyperemia of tunica mucosa nasi and the infiltration of inflammatory cells in these groups were also ameliorated，when compared to that in model group.Conclusion：The symptom of rhinitis and pathologic tissue damage were improved by new Guominjian and Majie granule，certifying that these two drugs have the effects of anti-inflammation and antiallergy，and its mechanism was presumed to regulating the balance of interleukin-4 and interferon-γ in serum.

allergic rhinitis（AR）；new Guominjian；immunologic mechanism；experimental study

R285.5

A

1671-0258（2015）05-0013-04

山西省基礎研究項目青年科技研究基金（2010021037－1）

李孝波，博士，副教授，E－mail：lixiaobo33@126.com

門九章，教授，博士研究生導師