正交設計優選復方熊膽茵陳顆粒水提醇沉工藝研究

闕金花，黃鳴清，鄭海音，徐 偉，李 煌，洪振豐，許舒瑜，劉 杰，林詩瑤

（1.福建中醫藥大學藥學院，福建 福州 350122； 2.福建中醫藥大學中西醫結合學院，福建 福州 350122）

正交設計優選復方熊膽茵陳顆粒水提醇沉工藝研究

闕金花1，黃鳴清1，鄭海音2，徐 偉1，李 煌1，洪振豐2，許舒瑜1，劉 杰1，林詩瑤1

（1.福建中醫藥大學藥學院，福建 福州 350122； 2.福建中醫藥大學中西醫結合學院，福建 福州 350122）

目的：優選復方熊膽茵陳顆粒的水提醇沉工藝條件。方法：以綠原酸、柴胡皂苷a的含量和浸膏得率為考察指標，正交試驗法優選水提醇沉最佳工藝條件。結果：最佳水提醇沉條件為加8倍量水提取2次，每次1.5 h；醇沉藥液相對密度1.2（50℃），醇沉乙醇濃度為70%，醇沉時間24 h。結論：該優選工藝方法簡便、穩定可行，可作為復方熊膽茵陳顆粒的提取純化工藝。

復方熊膽茵陳顆粒；水提醇沉；正交試驗；綠原酸；柴胡皂苷a

復方熊膽茵陳顆粒是由熊膽粉、茵陳、山楂、北柴胡等7味中藥組成的復方制劑，具有清肝利濕、化痰祛瘀的功效。本文在綜合考慮了與功能主治相關的主要有效成分的理化性質后，結合臨床用藥基礎、

水溶性顆粒劑的成型需要，對其水提及醇沉工藝進行了研究。本實驗采用水提法，選擇加水量、加熱回流時間、加熱回流次數三個因素；以及醇沉法，選擇醇沉濃度、醇沉時間、藥液密度三個因素，每個因素選擇3個水平，按L9（43）正交表安排實驗，均以綠原酸、柴胡皂苷a的含量和干膏率為考察指標，篩選水提醇沉最佳工藝。

1 儀器與試藥

1.1 實驗儀器

XS105電子分析天平（梅特勒-托利多國際股份有限公司）；U3000美國戴安高效液相色譜儀；電熱恒溫鼓風干燥箱DHG-9240（上海精宏實驗設備有限公司）；KQ-500DE超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；FW135中草藥粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；KDM調溫電熱套（山東甄城華魯電熱套儀器有限公司）；DLSB-5/40（低溫冷卻循環泵鄭州長城科工貿有限公司）；RE-52旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）；微孔濾膜（江蘇漢邦科技有限公司）。

1.2 藥物與試劑

澤瀉、茵陳、柴胡、山楂、白術、甘草（批號：10020504、20110901、11101702、20110901、1112801、11011807，均購自福州樂家老鋪藥事服務有限公司）；熊膽粉（批號：20120503，購自福建歸真堂藥業股份有限公司）；柴胡皂苷a對照品（批號：110777-200507，中國食品藥品檢定研究院）；綠原酸對照品（批號：110753-200413，中國食品藥品檢定研究院）。

2 方法與結果

2.1 水提工藝篩選

2.1.1 因素水平確定 本制劑在參照臨床使用情況以及中藥湯劑煎煮常規方法，采用水提法，以綠原酸、柴胡皂苷a的含量和干膏得率為指標，考察水煎煮過程的加水量、加熱回流時間、加熱回流次數對提取效果的影響，綜合考慮預實驗及單因素考察結果，用L9（43）正交表安排實驗，因素水平見表1。

表1 水提因素水平表

2.1.2 正交實驗提取液的制備 精密稱取正交實驗樣品，平行稱取9份，依L9（43）正交實驗表條件分別制備樣品，藥液80℃減壓濃縮并定容至125 mL即可。

2.1.3 柴胡皂苷a含量測定

2.1.3.1 液相色譜條件 Diamonsil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈-水（40∶60），檢測波長為203 nm，進樣量10 μL，流速1.0 mL/min，柱溫30℃［1-2］。

2.1.3.2 溶液的制備 對照品溶液的制備：精密稱取柴胡皂苷a對照品0.003 70 g于10 mL量瓶中，加甲醇定容，混勻，即得對照品溶液。

供試品溶液的制備：精密量取正交實驗提取液10 mL于蒸發皿中，蒸干，加入20 mL含5%濃氨試液的甲醇溶液，超聲30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣用甲醇溶解并定容至5 mL，過微孔濾膜，進液相測定。

陰性對照品溶液的制備：取缺柴胡的處方量藥材，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.1.3.3 專屬性實驗 取“2.1.3.2”項下溶液，按“2.1.3.1”項下條件測定。供試品溶液于柴胡皂苷a對照品出峰處出峰，而柴胡陰性樣品在該位置未出峰，表明復方中其他藥味對測定結果無影響，本方法專屬性良好。結果見圖1。

圖1 柴胡皂苷a HPLC圖譜

2.1.4 綠原酸含量測定

2.1.4.1 液相色譜條件 Ultimate XB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液（10∶90），檢測波長為327 nm，進樣量10 μL，流速1.0 mL/min，柱溫30℃［1］。

2.1.4.2 溶液的制備 對照品溶液的制備：精密稱

取綠原酸對照品0.000 19 g于棕色量瓶中，加50%甲醇制成每1 mL含19 μg的溶液。

供試品溶液的制備：精密量取正交實驗提取液10 mL于蒸發皿中，蒸干，加入10 mL甲醇，稱定重量，超聲30 min，放冷，稱定重量，用50%甲醇補足減失重量，混勻，濾過，濾液蒸干，過微孔濾膜后，進液相測定。

陰性對照品溶液的制備：取缺茵陳、山楂的處方量藥材，按供試品制備方法制備陰性對照品溶液。

2.1.4.3 專屬性實驗 取“2.1.4.2”項下溶液，按“2.1.4.1”項下液相條件測定。結果見圖2。

圖2 綠原酸HPLC圖譜

由圖2可以看出，供試品溶液于綠原酸對照品出峰處出峰，而陰性樣品在該位置處未出峰，故此色譜條件下，表明復方中其他藥味對綠原酸測定結果無影響，本方法專屬性良好。

2.1.5 方法學考察

2.1.5.1 線性關系考察 精密稱取柴胡皂苷a、綠原酸對照品0.016 15 g、0.008 00 g于25 mL量瓶中，分別用甲醇、50%甲醇定容，得對照品溶液，作為儲備液。分別精密吸取對照品儲備液0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、4.0 mL、6.0 mL、8.0 mL于10 mL量瓶中，各自用相應溶劑定容得系列對照品溶液。按上述色譜條件進樣測定，測定峰面積。以柴胡皂苷a濃度（mg/ mL）為橫坐標Χ，峰面積積分值為縱坐標Y，綠原酸濃度（mg/mL）為橫坐標Χ，峰面積積分值為縱坐標Y，繪制標準曲線，進行線性回歸。柴胡皂苷a的線性回歸方程：Y=50.06X－0.008 5，r=0.999 98，線性范圍0.032 3 mg/mL～0.516 8 mg/mL；綠原酸的線性回歸方程：Y=0.358 1X－0.238 1，r=0.999 9，線性范圍16 μg/mL～256 μg/mL。

2.1.5.2 重復性實驗 稱取樣品6份，照供試品溶液制備方法制備溶液，按上述色譜條件進樣測定，測定峰面積。結果6份樣品中柴胡皂苷a和綠原酸色譜峰面積RSD為0.87%和1.55%，表明本方法的重復性良好。

2.1.5.3 穩定性實驗 制備一供試品溶液，按上述色譜條件分別于0 h、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h進行測定。結果柴胡皂苷a和綠原酸色譜峰面積RSD分別為1.34%和1.72%，表明供試品溶液在24 h內基本穩定。

2.1.5.4 加樣回收率實驗 精密吸取9份已知柴胡皂苷a、綠原酸含量的樣品溶液，分別加入相應量的柴胡皂苷a、綠原酸對照品，按供試品溶液制備方法制備溶液，在上述色譜條件測定峰面積。結果見表2、表3。

表2 柴胡皂苷a加樣回收率實驗結果

表3 綠原酸加樣回收率實驗結果

2.1.6 正交實驗 照正交實驗安排（表4），分別測定9份供試品溶液中柴胡皂苷a、綠原酸的含量和干膏率。

干膏率的測定：分別精密吸取樣品20 mL藥液于已恒重的蒸發皿中，水浴蒸干，105℃干燥至恒重，取出，置干燥器內冷卻30 min，迅速稱重，計算處方藥材提取的干膏率。分別進行直觀分析和方差分析，

結果見表4和表5。

由于對不同的指標，其影響因素的主次與最佳因素水平不一致，因此，考慮柴胡皂苷a和綠原酸的含量采用加權評價的方法，含量評分時以各含量的最大值為參照，對數據進行歸一化法，其中柴胡皂苷a和綠原酸的含量權重系數分別為0.5和0.5，以柴胡皂苷a和綠原酸的含量評分及干膏率作為指標篩選最佳的提取工藝。

表4 水提正交設計實驗結果

表5 水提含量評分方差分析

由實驗結果的直觀分析及方差分析可知，考慮提取含量，在所選因素水平范圍內，各因素作用主次順序為A＞C＞B；考慮干膏率，由直觀分析表明各因素作用主次順序為C＞A＞B。方差分析表明，因素A（加水量）、因素B（提取時間）和因素C（提取次數）對柴胡皂苷a和綠原酸的提取都有統計學意義（P＜ 0.05），對干膏率影響意義不大（P＞0.05）。

由于本水提工藝實驗由含量評分和浸膏率兩個指標組成，兩個指標判斷標準不一，所以決定采取加權評分法進行綜合評判。方法如下：含量評分最高得100分，最低得0分，以含量為橫坐標，得分為縱坐標，將最高最低兩點代入，得直線方程Y=204.0X－104.0，分別將正交表中的各個轉移率代入，得到相應的分值。干膏率最低得100分，最高得0分，以干膏率為橫坐標，得分為縱坐標，將最高最低兩點代入，得直線方程Y=－7.974X+224.6，分別將正交表（表4）中的各個干膏率代入，得到相應的分值。水提綜合評分結果見表6和表7。

y=a×0.7+b×0.3，y為綜合評分，a為含量得分，b為浸膏率得分。

表6 水提綜合評分結果

表7 水提綜合評分方差分析結果

從綜合評分角度分析，根據其極差大小來看，其影響因素順序為加水量（A）＞提取時間（B）＞提取次數（C）；從其方差分析來看，加水量相對于提取時間和提取次數有統計學意義。因此，最佳提取工藝為A3B2C3，但A2和A3的結果接近，對A2B2C3和A3B2C3進行比較實驗，為進一步簡化工藝及更符合大生產實際條件，進行A2B2C3和A2B2C2兩者工藝的比較實驗。結果見表8。

表8 水提工藝考察結果

2.1.7 正交實驗的結論與驗證 通過進一步的實驗，工藝所測得的柴胡皂苷a、綠原酸的含量均相差不大，考慮生產實際情況和簡化工藝，最后確定提取的最佳方案為A2B2C2，即加入8倍水，每次1.5 h，提取2次。并對此工藝進行了驗證，表明此工藝合理、可靠。結果見表9。

表9 最佳工藝驗證結果

2.2 醇沉工藝考察

2.2.1 因素水平確定 復方熊膽茵陳顆粒原處方日服生藥量大，所得浸膏量大；藥材中有多糖、蛋白質、無機鹽類等雜質，乙醇沉淀法是中藥水提液常用的純化精制方法，本方采用醇沉的純化工藝。以綠原酸、柴胡皂苷a和干膏率為指標進行考察，通過對醇沉濃度、醇沉時間及藥液密度進行單因素考察結果，醇沉正交實驗采用L9（43）正交表安排實驗，L9（34）正交表以醇沉濃度、醇沉時間、藥液密度為考察因素，因素水平見表10。

表10 醇沉工藝因素水平表

2.2.2 含量測定 液相條件：柴胡皂苷a液相色譜條件同“2.1.3.1項”，綠原酸液相色譜條件同“2.1.4.1項”。

樣品制備：按最佳水提工藝提取制備藥液，等分成9份，按照表10進行醇沉靜置后，藥液濾過，濾液回收至無醇味，加水定容至50 mL。

綠原酸含量測定的溶液制備：取上述9份樣品，精密吸取0.8 mL于10 mL量瓶中，加甲醇定容并使其最終醇濃度為50%，超聲30 min，取出，冷卻，濾過，濾液進液相測定。

柴胡皂苷a含量測定的溶液制備：取上述9份樣品，精密吸取10 mL，蒸干，加入含5%濃氨試液的甲醇溶液，超聲30 min，濾過，濾液蒸干，加甲醇定容至10 mL，濾過，取續濾液進液相測定。

干膏率測定：分別精密吸取柴胡皂苷a樣品測定的溶液10 mL藥液于已恒重的蒸發皿中，水浴蒸干，105℃干燥至恒重，取出，置干燥器內冷卻30 min，迅速稱重，計算處方藥材提取的浸膏得率。

按上述條件測定樣品中綠原酸和柴胡皂苷a含量及干膏率。結果見表11、表12和表13。

表11 醇沉綜合評分結果（以1日處方量計）

表12 醇沉含量評分方差分析

表13 醇沉浸膏率方差分析

由實驗結果的直觀分析及方差分析可知，在所選因素水平范圍內，各因素作用主次順序為B＞A＞C，考慮綠原酸和柴胡皂苷a醇沉后含量，因素B（醇沉濃度）有顯著性影響，各因素最佳水平為A3B2C2；考慮浸膏得率，因素A（藥液密度）和因素B均有顯著性影響，因純化目的主要是使患者能在達到同樣療效的前提下減少服用劑量，浸膏量要盡量少，因此各因素最佳水平為A3B2C3。綜合上述實驗結果且考慮到減少生產時間，縮短生產周期，最佳的純化工藝是A3B2C2，即水提藥液濃縮到相對密度1.2（50℃），加乙醇使其終濃度為70%，攪拌充分，靜置24 h。

2.2.3 醇沉最佳工藝實驗驗證 取處方量藥材按最佳水提工藝進行提取，并按A3B2C2進行醇沉實驗驗證，平行做3份，結果見表14。

由表14結果表明，按最佳提取醇沉方案實驗，出膏率可控制在12%左右，而柴胡皂苷a和綠原酸的轉

移率大于80%，說明以上醇沉工藝是穩定可行的。

表14 最佳工藝驗證結果（以1日處方量計）

3 討論

臨床上，復方熊膽茵陳顆粒系福建中醫藥大學阮時寶教授的臨床經方，具有清肝利濕、化痰祛瘀之功。對肝膽濕熱、痰濁血瘀型脂肪肝有較好療效。原方在臨床上使用的劑型是湯劑，患者用藥一個月后癥狀明顯改善，表明水煎煮液在臨床上效果明顯。

對處方中各中藥進行簡單分析發現，方中熊膽粉用量少且為珍貴藥材，易溶于水，因此我們不經提取直接以原粉末入藥。茵陳為復方中主要藥味，茵陳利肝膽退濕熱的藥效研究效果明顯，有效成分主要有綠原酸、茵陳香豆酸A、茵陳香豆酸B、6，7－二甲氧基香豆素、茵陳色原酮等［3－5］，在2010年版《中國藥典》茵陳項下的質量控制是對綠原酸的含量測定［1］。方中另一味藥材山楂也含有綠原酸成分［6］，且綠原酸是一種重要的生物活性物質，具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗炎、抗內毒素、保肝利膽、抗腫瘤、增高白血球、降血壓、降血脂、清除自由基和興奮中樞神經系統等作用［7－11］。澤瀉提取物能降低大鼠因D－氨基半乳糖和四氯化碳引起急性肝損傷的ALT水平，從而保護肝損傷［12］。北柴胡醇提物和水提物均能不同程度降低血清中天冬氨酸氨基轉移酶（AST），丙氨酸氨基轉移酶（ALT），血清堿性磷酸酶（ALP），腫瘤壞死因子（TNF－α）從而預防乙酰氨基酚和他克林所致小鼠急性肝損傷有一定的保護作用［13－14］。白術對肝臟和對體內油脂類的調節主要有效成分有多糖類、白術內酯、聚乙炔化合物。結合臨床用藥基礎及水溶性顆粒劑的成型需要，本研究以各藥味不同極性活性成分綠原酸、柴胡皂苷a為指標比較水提和醇提法，從而優選復方的提取工藝。水提取法柴胡皂苷a、綠原酸的含量均高于醇回流法，選用水作為提取溶媒，但水煮法浸膏得率較大，選用乙醇溶媒純化一些雜質，降低浸膏率。故確定了水提醇沉的制備工藝路線。

實驗前期對各因素進行單因素考察：提取時間考察0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h，結果表明提取2.0 h溶液中柴胡皂苷a含量最大，而綠原酸提取時間為1.5 h時的含量最高。柴胡皂苷a、綠原酸含量隨提取時間的增加而增大，在提取初期，兩種成分含量增長都很快，但越接近提取終點，柴胡皂苷a成分擴散越慢，說明已接近提取完全，而提取2.0 h后綠原酸含量有所下降，可能綠原酸長時間加熱易分解，所以選擇1.0 h、1.5 h、2.0 h做正交實驗。加水量考察6倍、8倍、10倍、12倍的影響，柴胡皂苷a的含量隨提取溶劑倍數的增加而增大，而綠原酸的含量隨料液比增加而增大，隨后又減小，在加入溶劑為8倍時達到最大。綜合考慮選擇加入溶劑量6倍、8倍、10倍做正交實驗。提取次數考察提取1次、2次、3次、4次的影響，結果表明柴胡皂苷a和綠原酸含量隨提取次數增加而增大，而提取3次后，繼續增加提取次數，柴胡皂苷a和綠原酸的提取率增大不明顯，因此選擇提取1次、2次、3次做正交實驗。綜合以上，所以選擇提取時間為1.0 h、1.5 h、2.0 h；加水量為6倍、8倍、10倍；提取次數為1次、2次、3次做正交實驗。

按正交實驗方法，結果最佳提取工藝條件為加入10倍量水，提取3次，每次1.5 h，根據其極差大小來看，其影響因素順序為加水量（A）＞提取時間（B）＞提取次數（C），從其方差分析看，加水量相對于提取時間和提取次數有統計學意義。但自選提取工藝條件為加入8倍量水，提取3次，每次1.5 h的指標成分與其較相近，通過進一步的實驗，兩種工藝所測得的柴胡皂苷a、綠原酸的含量均相差不大，為了降低能耗，縮短生產周期，通過優選確定提取工藝條件為1∶8倍量水，提取2次，每次1.5 h。

通常含醇量為50%～60%時可除去淀粉等雜質；含醇量達60%時，無機鹽開始沉淀；含醇量達75%時，可除去蛋白質等雜質，但含醇量達80%時，幾乎可除去全部淀粉、多糖、蛋白質等雜質。取處方量藥材，按最佳工藝提取，濃縮至相對密度為1.1的溶液，加乙醇使醇終濃度為60%、70%、80%，靜置24 h，濾過，濾液回收乙醇至無醇味。結果表明當醇沉濃度為70%時，所測得綠原酸、柴胡皂苷a的含量較高，且浸膏得率相對較少，因此選用60%、70%、80%做醇沉正交實驗。醇沉時間與藥液溫度有直接的關系，醇沉時間越長，醇沉的沉淀沉降的充分，固液能充分分離，同時也增加了生產周期。取處方量藥材，按最佳工藝提取，濃縮至相對密度為1.1的溶液，加乙醇使醇終濃度為70%，分別靜置12 h、24 h、36 h，濾過，濾液回收乙醇至無醇味。結果表明當醇沉靜置24 h時，所測得綠原酸、柴胡皂苷a的含量較高，且浸膏得率適宜，因此選用12 h、24 h、36 h做醇沉正交實驗。藥液的密度過大，藥液因長時間煎煮濃縮，易使苷類、萜類、維生素等成分破壞，且造成淀粉糊化，藥液黏稠度較大，醇沉時形成大塊，包裹了有效

成分，乙醇與藥液難以充分接觸，造成有效成分的損失；藥液密度太小時，藥液的量較多，需要耗費大量乙醇，且相對密度太小藥液比較稀，形成的沉淀不易聚結，難以下沉。因此選擇適宜的藥液密度對醇沉工藝非常重要。因此本實驗考察的藥液相對密度有0.9、1.0、1.1、1.2.（50℃）。取處方量藥材，按最佳工藝提取，濃縮至適宜相對密度的溶液，加乙醇使醇終濃度為70%，靜置24 h，濾過，濾液回收乙醇至無醇味。結果表明，藥液相對密度不同，所測得綠原酸含量有一定的差別，其中相對密度為1.2時所測得綠原酸含量相對較大，本方藥液密度相對密度為1.3時，藥液較稠，加入乙醇后形成塊狀，藥液與乙醇難以充分接觸。因此選用相對密度1.0、1.1、1.2做醇沉正交實驗。綜合以上，所以選擇含醇量為60%、70%、80%；醇沉時間為12 h、24 h、36 h；藥液相對密度為1.0、1.1、1.2做正交實驗。

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（編輯：梁葆朱）

Technology research of water extracting-alcohol precipitating of compound Xiongdan Yinchen particles by orthogonal design

Que Jinhua1，Huang Mingqing1，Zheng Haiyin2，Xu Wei1，Li Huang1，Hong Zhenfeng2，Xu Shuyu1，Liu Jie1，Lin Shiyao1
（1.College of Pharmacy，Fujian University of TCM，Fuzhou Fujian 350122； 2.College of Integrated Treditional Chinese and Western Medicine，Fujian University of TCM，Fuzhou Fujian 350122）

Objective：To optimize technology conditions of water extracting-alcohol precipitating of compound Xiongdan Yinchen particles.Methods：Orthogonal test was adopted and the contents of chlorogenic acid，saikosaponin a and the yield of extractum were as indices.Results：The optimum technology conditions were as follows：8 times quantity of water extracts 2 times，1 times per 1.5 h；the relative density of alcohol precipitation solution was 1.2（50℃），the concentration of alcohol was 70%，and the alcohol precipitation time was 24 h.Conclusion：The optimization method is simple and stable，could be used as the technology of extraction and purification of compound Xiongdan Yinchen particles.

compound Xiongdan Yinchen particles；water extracting-alcohol precipitating；orthogonal test；chlorogenic acid；saikosaponin a

R284.2

A

1671-0258（2015）05-0020-07

福建省科技重大專項（2010YZ0001-1）

闕金花，E-mail：275376859@qq.com

徐偉，碩士研究生導師，E-mail：xwfjtcm@sina.com